DMOG改善骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生存能力以及相關(guān)機(jī)制的探討.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景： 隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，心腦血管疾病已經(jīng)成為人類健康的頭號(hào)殺手。心肌梗死的發(fā)生率、致殘率和致死率明顯上升，盡管近年來(lái)藥物治療和介入治療得到了快速發(fā)展，缺血性心肌病患者的預(yù)后有了明顯的改善，但藥物治療和介入治療終歸不能修復(fù)壞死的心肌。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有自我更新能力和橫向分化能力，移植到心梗局部后能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞樣細(xì)胞，促進(jìn)新生血管的形成。大量的基礎(chǔ)研究和臨床前期

2、研究發(fā)現(xiàn)MSCs能夠挽救瀕死的心肌，減少心梗面積進(jìn)而改善心肌梗死后的心功能，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在心血管疾病中的應(yīng)用是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，成為攻克心血管疾病難題的一種非常有前景的治療手段。但是，MSCs改善心功能的能力有限，大量的證據(jù)表明MSC移植對(duì)心功能的改善是輕中度的，大部分研究結(jié)果顯示MSCs移植對(duì)心功能的改善只有5-6％左右，甚至有些臨床試驗(yàn)沒有觀察到心功能的改善，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到我們的預(yù)期，其中一個(gè)很重要的原因是絕大多數(shù)的細(xì)胞移植到

3、體內(nèi)后在很短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生死亡，研究報(bào)道90％的MSCs在移植后的1天內(nèi)死亡。因此，找到一種能夠提高M(jìn)SCs生存能力的方法顯得尤為迫切。 DMOG是一種脯氨酰羥化酶抑制劑，能夠抑制細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的降解，繼而使細(xì)胞核內(nèi)很多基因(如EPO、VEGF、Ang1和Glut-1等)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增高，繼而發(fā)揮其保護(hù)性作用。在缺血再灌注心肌損傷和急性心肌梗死的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，DMOG能夠發(fā)揮降低大鼠的心肌重構(gòu)和抑制炎癥反應(yīng)等保護(hù)作用。在體外

4、的研究中發(fā)現(xiàn)，DMOG能夠改善腫瘤細(xì)胞和神經(jīng)元在缺血清或缺神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等惡劣環(huán)境下的生存能力。但是，DMOG到底能否改善MSCs的生存能力目前沒有報(bào)道。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?研究DMOG是否能增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的生存能力，并對(duì)可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討。 實(shí)驗(yàn)方法： 建立經(jīng)典的缺血清的凋亡模型，分為正常對(duì)照組(Control)、缺血清組(SD)和缺血清DMOG干預(yù)組(SD+DMOG)三大組，其中SD+D

5、MOG組又分為100μM、500μM和1000μM三個(gè)小組。應(yīng)用western-blot技術(shù)檢測(cè)DMOG能否降低HIF-1α的在細(xì)胞內(nèi)的降解以及上調(diào)其下游Glut-1的表達(dá)情況；應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)方法來(lái)評(píng)估DMOG對(duì)正常有血清條件培養(yǎng)下的MSCs的毒性作用；通過相差顯微鏡觀察不同組中MSCs形態(tài)學(xué)上的改變，經(jīng)缺血清處理后的凋亡細(xì)胞體積縮??；應(yīng)用Hoechst染MSCs的細(xì)胞核，通過熒光顯徼鏡觀察不同組中MSCs細(xì)胞核的改變，凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃聚、

6、細(xì)胞核縮小甚至斷裂，熒光顯微鏡下表現(xiàn)為核小雨亮和不完整；應(yīng)用免疫組化對(duì)cleavedcaspase-3進(jìn)行染色，陽(yáng)性細(xì)胞定義為凋亡細(xì)胞，并使用Hoechst進(jìn)行染核計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞除以總細(xì)胞數(shù)即為凋亡率；western-blot檢測(cè)cleavedcaspase-3的表達(dá)情況，以進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組化染色的準(zhǔn)確性，并進(jìn)一步探討DMOG對(duì)MSCs凋亡保護(hù)的時(shí)程進(jìn)行分析，分6h、12h和24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)；應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)方法對(duì)MSCs進(jìn)行染色來(lái)檢

7、測(cè)細(xì)胞死亡情況，陽(yáng)性細(xì)胞即為死亡細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞除以總細(xì)胞數(shù)即為死亡率。通過比較不同組之間凋亡和死亡指標(biāo)的變化，說明DMOG對(duì)缺血清條件下MSCs的保護(hù)作用。對(duì)于除HIF-1α通路外其他的可能作用機(jī)制，我們檢測(cè)了經(jīng)典的影響細(xì)胞凋亡的線粒體通路和與細(xì)胞生存密切相關(guān)的PI3K/Akt通路。應(yīng)用western-blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞色素C蛋白在線粒體、胞漿中的表達(dá)情況，分析在缺血清狀況下細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿中(細(xì)胞色素C將進(jìn)一步與Apaf

8、-1和pro-caspase9形成凋亡復(fù)合體激活凋亡通路)的情況，探討線粒體途徑中caspase-3依賴性的凋亡通路在DMOG抗凋亡中的作用；應(yīng)用western-blot技術(shù)檢測(cè)凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)在胞漿和核蛋白中的表達(dá)情況，分析在缺血清狀況下AIF從胞漿轉(zhuǎn)錄到細(xì)胞核(AIF轉(zhuǎn)錄到細(xì)胞核后也能夠啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序)的情況，探討線粒體途徑中非caspase-3依賴性的凋亡通路在DMOG抗凋亡中的作用，應(yīng)用western-blot技術(shù)檢測(cè)A

9、kt和磷酸化Akt、ERK和磷酸化ERK的表達(dá)情況，明確DMOG能否激活PI3K/Akt和/或MEK/ERK通路，然后應(yīng)用PI3K特異性阻斷劑wortmannin阻斷PI3K/Akt通路后，觀察DMOG的保護(hù)作用(重新檢測(cè)cleavedcaspase-3染色和臺(tái)盼藍(lán)分別評(píng)估細(xì)胞凋亡和死亡)是否消失，從反面來(lái)證明DMOG的保護(hù)作用是否通過該通路。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： DMOG在作用濃度范圍內(nèi)，對(duì)MSCs沒有明顯的毒性作用，卻能夠劑

10、量依賴性地降低MSCs內(nèi)HIF-1α的降解，上調(diào)其下游Glut-1的表達(dá)。DMOG能夠呈劑量依賴性地改善缺血清后MSCs的形態(tài)學(xué)上的細(xì)胞縮小情況，使Hoechst陽(yáng)性的細(xì)胞核數(shù)量明顯降低，cleavedcaspase-3的表達(dá)降低。Western-blot結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了免疫染色cleavedcaspase-3的結(jié)果，并提示從缺血清6h開始，DMOG就有降低凋亡的趨勢(shì)，到12h和24h時(shí)達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.類似地，根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果DMO

11、G能夠呈劑量依賴性地降低MSCs經(jīng)缺血清處理后的細(xì)胞死亡，從12h開始到72h均能不同程度地降低細(xì)胞死亡，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上說明DMOG能夠降低缺血清所引起的MSCs凋亡和死亡，并呈劑量依賴性和有一定的作用時(shí)程。缺血清能夠使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿的數(shù)量增加，而DMOG卻能降低這種過程；類似地，DMOG能夠降低缺血清所引起的AIF的從胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，說明DMOG能夠降低caspase依賴的和非依賴的凋亡通路而發(fā)揮保護(hù)作用

12、。缺血清能夠明顯降低MSCs的Akt和ERK的磷酸化水平，DMOG能夠逆轉(zhuǎn)Akt的磷酸化表達(dá)水平而不能逆轉(zhuǎn)ERK的活化，提示PI3K/Akt通路而不是MEK/ERK通路可能在DMOG的保護(hù)中發(fā)揮一定的作用.應(yīng)用PI3K/Akt通路的特異性阻斷劑wortamannin后，發(fā)現(xiàn)DMOG逆轉(zhuǎn)的Akt磷酸化水平作用消失，相應(yīng)地，DMOG對(duì)MSCs凋亡和死亡的保護(hù)作用(分別由cleavedcapase-3和臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè))也消失了，這從反面也證實(shí)

13、了PI3K/Akt通路在DMOG保護(hù)中的作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1、DMOG能夠降低MSCs內(nèi)HIF-1α的降解和上調(diào)下游Glut-1的表達(dá)，在作用濃度下對(duì)MSCs沒有明顯的毒性作用； 2、DMOG能夠降低缺血清狀況下MSCs的凋亡和死亡； 3、caspase-3依賴的和非依賴的線粒體通路可能在DMOG對(duì)MSCs保護(hù)中發(fā)揮了一定的作用； 4、PI3K/Akt通路在DMOG對(duì)MSCs的保護(hù)中發(fā)揮了重要的