植入期二硫化碳暴露對小鼠子宮組織氧化應(yīng)激、DNA損傷及甲基轉(zhuǎn)移酶表達的影響.pdf

1、研究背景
　　二硫化碳(Carbondisulfide，CS2)是工業(yè)上常用的有機溶劑和化工原料，廣泛用于粘膠纖維、玻璃紙、橡膠等的生產(chǎn)過程中。CS2具有多系統(tǒng)毒性，長期低劑量暴露于CS2可導(dǎo)致神經(jīng)、心血管、內(nèi)分泌系統(tǒng)等的病變。此外，值得關(guān)注的是CS2具有明顯的生殖損傷毒作用，可導(dǎo)致男性睪丸萎縮、精子質(zhì)量下降、性功能減退、性激素分泌紊亂等，并可導(dǎo)致女性月經(jīng)周期紊亂、自然流產(chǎn)、早產(chǎn)等。本課題組通過前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)，暴露組女工早早孕

2、丟失率顯著高于對照組，并且暴露組女工的妊娠時間與對照組相比明顯延長，說明CS2影響胚胎的著床過程。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在圍植入期暴露于CS2導(dǎo)致胚胎植入數(shù)目明顯減少，但其毒性作用機制尚未明確。
　　氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA損傷及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變。研究表明，接觸CS2可引起機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，機體處于高氧化應(yīng)激水平可增加自然流產(chǎn)的風(fēng)險。提示孕期CS2暴露可以通過改變機體的氧化應(yīng)激水平而影響胚胎正常著床。課題組前期實驗

3、結(jié)果顯示，胚胎植入期暴露于CS2可導(dǎo)致孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷，但與氧化應(yīng)激的關(guān)系尚不明確。DNA甲基化可以影響基因轉(zhuǎn)錄過程調(diào)節(jié)植入相關(guān)蛋白的表達水平，影響胚胎植入。DNA甲基化在調(diào)節(jié)基因功能過程中需要甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的參與。Logan等研究發(fā)現(xiàn)，低甲基化水平可以增強子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性，有利于胚胎植入。氧化應(yīng)激可引起機體DNA甲基化水平的改變，同時氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA氧化損傷可啟動機

4、體的堿基切除修復(fù)過程，而參與堿基切除修復(fù)的有關(guān)酶需要經(jīng)過甲基化后才能發(fā)揮作用。綜上，我們推測在DNA氧化損傷后，需要DNMT的高表達以啟動DNA損傷修復(fù)過程。因此，我們假設(shè)在孕鼠暴露于CS2后，氧化應(yīng)激、DNA損傷和DNA甲基化的單獨或聯(lián)合作用是胚胎植入障礙的重要機制。
　　本研究擬運用不同胚胎植入時段CS2暴露與胚胎植入障礙關(guān)系的時間依賴動物模型，檢測暴露后不同染毒時間點和觀察終點孕鼠子宮組織的氧化應(yīng)激、子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷、

5、DNA氧化損傷生物標(biāo)志物8-OH-dG以及DNMT表達水平，探討氧化應(yīng)激、DNA損傷及DNA甲基化在CS2致胚胎植入障礙中的毒性作用機制。
　　研究目的
　　構(gòu)建胚胎植入期不同時點暴露于CS2致胚胎植入障礙動物模型，檢測不同染毒時間點與不同觀察終點的孕鼠子宮組織氧化應(yīng)激、子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷、8-OH-dG以及DNMT表達水平，分析氧化應(yīng)激、DNA損傷和DNA甲基化在CS2所致的胚胎植入障礙中的作用及其致病機制，進一步加深

6、對圍植入期CS2暴露所致胚胎植入障礙毒作用機制的了解，為環(huán)境因素生殖損傷研究提供可借鑒的理論依據(jù)和研究方法。
　　研究方法
　　1.研究設(shè)計
　　研究設(shè)計分為三部分。第一部分用于建立CS2暴露致胚胎植入障礙時間依賴動物模型，通過胚胎植入障礙現(xiàn)象尋找CS2致胚胎植入障礙敏感暴露時間點，并檢測孕鼠子宮組織氧化應(yīng)激水平，分析氧化應(yīng)激在CS2致胚胎植入障礙機制中的作用。第二部分在第一部分實驗的基礎(chǔ)上，選擇CS2致胚胎植入障礙敏

7、感時點使孕鼠暴露于CS2，并在不同時點終止實驗，檢測孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷和子宮組織8-OH-dG水平，分析在CS2致胚胎植入障礙毒作用機制中DNA損傷的作用及DNA損傷與氧化應(yīng)激的關(guān)系。第三部分動物處理同第二部分，檢測孕鼠子宮組織中DNMT表達水平，分析在CS2致胚胎植入障礙毒作用機制中DNA甲基化的作用。
　　2.暴露時間
　　本實驗根據(jù)CS2暴露時間的不同分為4種處理，即動物分別在孕3d、孕4d、孕5d和孕6d（記

8、為GD3、GD4、GD5和GD6）接受一次處理（CS2或溶劑）。
　　3.觀察終點
　　選取暴露后的連續(xù)時間點作為觀察終點，四種處理共有26個觀察終點，即第一個處理組分別在暴露后第6h、12h、18h、24h、48h、72h、96h和144h（即GD9）共設(shè)有8個觀察終點;第二個處理組分別在暴露后6h、12h、18h、24h、48h、72h和120h（即GD9）共設(shè)有7個觀察終點;第三個處理組分別在暴露后6h、12h、18h

9、、24h、48h和96h（即GD9）共設(shè)有6個觀察終點;第四個處理組分別在暴露后6h、12h、18h、24h和72h（即GD9）共設(shè)有5個觀察終點。
　　各處理組的最后1個觀察終點(GD9)用于觀察母體毒性及胚胎植入數(shù)目，其余各觀察終點用于檢測氧化應(yīng)激、DNA損傷及DNMT1表達水平等。每個觀察終點包含1個CS2暴露組和1個溶劑對照組。
　　4.動物受孕與分組
　　實驗前清潔級性成熟昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，按雌雄1∶

10、1合籠，次日晨檢查陰栓，陰栓陽性者記為孕第一天（記為GD1），隨機分到26個觀察終點。每個觀察終點組含12只孕鼠，再隨機分配進入暴露組和對照組（各含6只孕鼠）。
　　5.孕鼠處理
　　孕鼠分別按照實驗設(shè)計的暴露時點接受1次腹腔注射（CS2暴露劑量為631.4mg/kg，染毒前配置;對照組為橄欖油）;注射容量為0.1ml/10g體重。
　　6.樣本收集
　　4種處理組中最后一個觀察終點(GD9)的孕鼠在孕9d經(jīng)脫臼

11、處死，取子宮、卵巢、肝、脾、腎和胚胎并稱重，計數(shù)胚胎植入數(shù)目;4種處理組中其他觀察終點的孕鼠在設(shè)計的觀察終點經(jīng)脫臼處死后取子宮組織，一半子宮組織經(jīng)手動勻漿后取上清液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。另一半子宮組織采用手工機械刮取法直接刮取孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞用于DNA損傷測定。
　　7.孕鼠子宮組織氧化應(yīng)激、DNA損傷、8-OH-dG和DNMT表達水平的測定
　　運用考馬斯亮藍(lán)法對暴露組和對照組孕鼠子宮組織勻漿液進行蛋白定量;運用分光光度

12、法測定孕鼠子宮組織勻漿液中丙二醛(MDA)、過氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和過氧化氫酶(CAT)水平;運用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzymeslinkedimmunosorbentassay，ELISA)測定孕鼠子宮組織中8-OH-dG含量;應(yīng)用彗星實驗(cometassay)檢測孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷水平;運用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(SDS-PAGE)和蛋白免疫印跡法(westernbl

13、otting)法測定孕鼠子宮組織中甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNAmethyltransferase1，DNMT1)含量。
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析
　　使用SPSS20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗，正態(tài)及近似正態(tài)分布的測量指標(biāo)均以(x)±s表示。首先對各指標(biāo)進行方差齊性檢驗:若方差齊，則采用單因素方差分析(ONE-WAYANOVA)進行F檢驗，同時采用Dunnett'sttest進行暴露組和對照組的比較;若方差不齊，則采用非參數(shù)統(tǒng)計方法

14、（Kruskal-WallisH法）。并運用相關(guān)分析分析各指標(biāo)間的關(guān)系。統(tǒng)計學(xué)檢驗水準(zhǔn)設(shè)定為α=0.05。
　　研究結(jié)果
　　1.圍植入期暴露于CS2對孕鼠母體及胚胎的毒性作用
　　母體毒性:孕鼠在胚胎植入不同時間點暴露于CS2后，孕鼠GD9體重和體重凈增量各暴露組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);孕鼠子宮、卵巢、肝、脾以及腎等臟器的重量及臟器系數(shù)組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。說明該暴露劑量

15、所致的母體毒性較小。
　　胚胎毒性:各暴露組胚胎植入數(shù)目均明顯低于對照組（P＜0.01）。GD3、GD4、GD5和GD6各暴露組的胚胎植入率分別為56.95％、36.26％、39.55％和52.74％，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），暴露CS2后胚胎植入率明顯降低，GD4暴露組的胚胎植入率最低(P＜0.05)。在校正胚胎植入數(shù)目后胚胎均重與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.圍植入期暴露于

16、CS2對孕鼠子宮組織氧化應(yīng)激的影響
　　CS2暴露后18h，各暴露組孕鼠子宮組織中MDA水平明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中GD4暴露組孕鼠子宮組織MDA水平較對照組增高131.4％，GD3、GD5和GD6較對照組分別增高120.8％、121.6％和104.9％。此外，不同暴露時間點不同觀察終點孕鼠子宮組織中SOD、GSH-PX和CAT水平明顯降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01):CAT水

17、平在暴露后12h明顯降低(P＜0.01)，GSH-PX水平在暴露后12h和18h明顯降低(P＜0.01)，SOD水平在暴露后18h顯著降低（P＜0.01）。相關(guān)分析結(jié)果顯示，暴露后18h孕鼠子宮組織中MDA水平和GD9胚胎植入數(shù)目呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.783，P＜0.01)。
　　3.圍植入期暴露于CS2對孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷的影響
　　孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷各項指標(biāo)（TL、TM、OTM和TDNA％）在CS2

18、暴露后6h時明顯升高(P＜0.01)，并在暴露后18h時達到最高點（P＜0.01），之后各指標(biāo)值逐漸下降。相關(guān)分析結(jié)果顯示，CS2暴露后18h時孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞TM、OTM、TL和TDNA％與胚胎植入數(shù)目之間呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.804、-0.847、-0.934和-0.863,P＜0.01)。
　　4.圍植入期暴露于CS2對孕鼠子宮組織8-OH-dG水平的影響
　　與對照組比較，孕鼠CS2暴露后18h和24h時孕鼠子

19、宮組織8-OH-dG水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在18h和24h時孕鼠子宮組織8-OH-dG水平與對照組比較，分別升高893.8％和647.4％(P＜0.01)。
　　5.圍植入期暴露于CS2對孕鼠子宮組織DNMT1水平的影響
　　孕鼠在GD4暴露于CS2后6h時孕鼠子宮組織DNMT1表達水平明顯降低，而在暴露后12h時孕鼠子宮組織DNMT1表達水平明顯升高，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01

20、)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，CS2暴露后12h孕鼠子宮組織DNMT1表達水平與胚胎植入數(shù)目之間呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.433，P＜0.01)。
　　6.氧化應(yīng)激、DNA損傷和8-OH-dG水平與CS2暴露的關(guān)系
　　孕鼠GD4暴露于CS2后DNA損傷各項指標(biāo)6h時出現(xiàn)明顯改變，而暴露于CS2后18h時子宮組織MDA升高具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示CS2所致孕鼠子宮組織DNA損傷改變早于氧化應(yīng)激變化。相關(guān)分析結(jié)果顯示，作為DNA氧化損傷

21、生物標(biāo)志物的8-OH-dG與DNA損傷指標(biāo)TDNA％、TL、TM和OTM之間呈正相關(guān)(r=0.766、0.688、0.738和0.771，P＜0.01)，且在氧化應(yīng)激最高點時子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷程度達到高峰，提示氧化應(yīng)激引起的DNA氧化損傷進一步加重孕鼠子宮組織的DNA損傷程度。
　　結(jié)論
　　1.圍植入期不同時間暴露于CS2均可導(dǎo)致孕鼠子宮組織發(fā)生明顯且短暫的氧化應(yīng)激反應(yīng)，呈現(xiàn)出明顯的時間變化規(guī)律且變化趨勢一致，與暴露時

22、點無關(guān)。
　　2.圍植入期暴露于CS2可導(dǎo)致孕鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷，并呈現(xiàn)出明顯的時間變化規(guī)律;氧化應(yīng)激通過引起DNA氧化損傷進一步加重子宮內(nèi)膜細(xì)胞的DNA損傷程度。
　　3.子宮組織氧化應(yīng)激水平和內(nèi)膜細(xì)胞DNA損傷水平與CS2致胚胎植入障礙程度一致，兩者協(xié)同作用可能是CS2暴露致胚胎植入障礙的重要機制之一。
　　4.圍植入期暴露于CS2導(dǎo)致的子宮組織DNMT1表達水平的變化，可能與機體在氧化應(yīng)激和細(xì)胞DNA損傷毒