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文檔簡介
1、目的:
本課題以人淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞為體外模型,研究雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide,TPL)對(duì)Raji細(xì)胞的生長抑制作用,分析TPL對(duì)Raji細(xì)胞p15基因及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMT)的影響。希望通過對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇抑制Raji細(xì)胞生長的機(jī)理研究,為淋巴瘤的治療提供新的思路和策略。
方法:
(1)分別用0、5、10、15、20ng/ml T
2、PL作用Raji細(xì)胞24h、48h、72好,采用CCK-8法研究TPL對(duì)Raji細(xì)胞增殖作用的影響。
(2)分別用不同濃度TPL處理Raji細(xì)胞24h,采用瑞氏染色光學(xué)顯微鏡觀察TPL作用后Raji細(xì)胞形態(tài)的變化。
(3)用不同濃度TPL處理Raji細(xì)胞24h,采用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)凋亡的特征性梯形條帶。
(4)用不同濃度TPL處理Raji細(xì)胞24h,采用Annexin-V/PI雙染流式細(xì)
3、胞儀技術(shù)檢測(cè)凋亡的細(xì)胞量。
(5)用不同濃度TPL處理Raji細(xì)胞24h,采用PI染色流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。
(6)用不同濃度TPL,處理Raji細(xì)胞24h,采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)p15、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達(dá)。
結(jié)果:
(1)TPLP對(duì)人淋巴瘤Raji細(xì)胞有抑制增殖作用。5、10、15、20ng/ml TPL作用Raji細(xì)胞24h,增殖抑
4、制率分別為:(11.02±2.00)%、(17.97±3.13)%、(31.07±3.90)%和(48.88±5.66)%;5、10、15、20ng/ml TPL作用Raji細(xì)胞48h,增殖抑制率分別為:(33.30±4.10)%、(48.15±2.02)%、(59.55±4.34)%和(69.05±4.78)%;5、10、15、20ng/ml TPL作用Raji細(xì)胞72h,增殖抑制率分別為(48.05±4.82)%、(65.90±7.
5、83)%、(69.74±4.06)%和(81.05±3.99)%。24h、48h、72h半數(shù)抑制率(IC50)分別為:23.68 ng/ml、10.04 ng/ml和5.50ng/ml。不同濃度TPL處理Raji細(xì)胞,具有不同的增殖抑制作用(24h,F(xiàn)=76.54,P<0.05;48h,F(xiàn)=75.80,P<0.05;72h,F(xiàn)=32.10,P<0.05)。Raji細(xì)胞經(jīng)TPL作用不同時(shí)間,其增殖抑制程度亦不同(5ng/ml,F(xiàn)=147.
6、25,P<0.05;10ng/ml,F(xiàn)=174.86,P<0.05;15ng/ml,F(xiàn)=119.31,P<0.05;20ng/ml,F(xiàn)=56.02,P<0.05)。TPL抑制Raji細(xì)胞增殖呈劑量依賴關(guān)系(24h,R=0.95,P<0.05;48h,R=0.96,P<0.05;72h,R=0.90,P<0.05)及時(shí)間依賴關(guān)系(5ng/ml,R=0.97,P<0.05;10ng/ml,R=0.97,P<0.05;15ng/ml,R=0.
7、94,P<0.05;20ng/ml,R=0.94,P<0.05)。
(2)5、10、15、20ng/mlTPL處理Raji細(xì)胞24h,細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征:光鏡下可見凋亡細(xì)胞胞體固縮、核固縮、核碎裂及凋亡小體。
(3)5、10、15、20ng/mlTPL處理Raji細(xì)胞24h,在DNA凝膠電泳中均顯示典型的凋亡DNA梯形條帶(DNA Ladder)。
(4)5、10、15、20ng/
8、mlTPL處理Raji細(xì)胞24h,以Annexin VFITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞膜外側(cè)磷脂酰絲氨酸(PS)的含量,Annexin V(+),PI(-)細(xì)胞百分比分別為:(0.10±0.10)%,(5.70±1.35)%,(7.07±0.75)%,(8.50±0.56)%,(11.63±1.07)%,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=70.23,P<0.05)。發(fā)生PS轉(zhuǎn)位的細(xì)胞百分比與藥物作用濃度正相關(guān)(r=0.95;P<0.05)。
9、> (5)5、10、15、20ng/ml TPL處理Raji細(xì)胞24h,以PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期,隨藥物濃度增加,亞G1期及G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加,同時(shí)S及G2/M期細(xì)胞比例逐漸減少。與對(duì)照組比較其差異有顯著性意義(亞G1期,F(xiàn)=138.86,P<0.05;G0/G1期,F(xiàn)=99.58,P<0.05;S期,F(xiàn)=117.49,P<0.05;G2/M期,F(xiàn)=14.66,P<0.05)。亞G1期細(xì)胞百分率增加呈藥物濃度依賴(r=0.
10、98,P<0.05)。S期細(xì)胞百分率與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)(r=0.98,P<0.05)。
(6)Raji細(xì)胞p15基因mRNA弱表達(dá)或不表達(dá)(陽性率13.30%),經(jīng)20 ng/mlTPL作用24h后,Raji細(xì)胞p15基因mRNA表達(dá)增加(陽性率53.30%),差異具顯著意義(F=5.40,P<0.05)。
(7)5、10、15、20ng/ml TPL處理Raji細(xì)胞24h,對(duì)DNMTI、DNMT3A、DNM
11、T3B mRNA有下調(diào)作用,且有劑量依賴(r值分別為-0.91、-0.96、-0.95,P值均<0.05)。
結(jié)論:
(1)5-20ng/ml劑量范圍內(nèi)的TPL對(duì)Raji細(xì)胞具有增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡作用,且呈劑量、時(shí)間依賴性。
(2)TPL對(duì)Raji細(xì)胞的生長抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用可能與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。
(3)TPL通過上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因p15 mRNA表達(dá),恢復(fù)該基因功能,使細(xì)
12、胞周期阻止于G0/G1期,可能是其誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡機(jī)制之一。
(4)TPL對(duì)Raji細(xì)胞DNMT1、DNMT3A、DNMT3B在mRNA水平有下調(diào)作用,且有劑量依賴。
(5)TPL下調(diào)Raji細(xì)胞DNMT1、DNMT3A、DNMT3a mRNA表達(dá),可能通過p15基因去甲基化,恢復(fù)p15基因功能,使細(xì)胞周期阻滯于G1期,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,這可能是TPL誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制之一。TPL對(duì)Raji細(xì)胞p15基因的去
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