DNA甲基轉移酶及甲基胞嘧啶結合蛋白對系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的影響.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種病因未明的累及全身多器官多系統(tǒng)鮑慢性進行性病譜性自身免疫瘋.一般認為在遺傳、環(huán)境、內分泌及慢病毒等綜合因素作用下,機體正常的免疫耐受機制被破壞,以至CD4+T淋巴細胞尤其是'l'h2激活,與自身多肽反應,自身反應性B細胞激活,IgG型自身抗體產生,進而導致SLE發(fā)病.目前關于SLE遺傳危險因素的研究比較多,但主要集中在HLA及其相關基因.遺傳免疫學研究發(fā)現(xiàn)人類大部分反映其進化過程的基因處于不表達狀態(tài),如果在

2、某些內外因素作用下導致其表達,則可能誘導自身抗原產生,引起自身免疫反應.表觀遺傳學觀點較好地解釋了這一現(xiàn)象,認為人類遺傳特性的正常表達不僅取決于基因物質的正確性,還受到DNA修飾程度的影響.DNA甲基化是在不改變基因DNA一級結構的情況下,改變其表達活性的基因外調節(jié)途徑,是哺乳動物細胞DNA最普遍的修飾過程,對哺乳動物的進化和發(fā)育有重要的調控作用.關于DNA甲基化狀態(tài)在SLE發(fā)病機制中的重要作用已經較為明確,然而對于SLE中DNA甲基化

3、異常的形成和調控機制尚不十分清楚.DNA甲基化狀態(tài)的維持主要受到兩個相反因素的調控,即甲基轉移酶(實現(xiàn)甲基化)和去甲基酶(降低甲基化),本研究旨在探討影響SLE患者DNA甲基化狀態(tài)的調控因素及其與發(fā)病的相互關系,將為進一步研究和防治SLE發(fā)病提供新的切入點. 1.通過分析1)SLE患者外周血單核細胞(PBMC)中DNA甲基轉移酶:DNMT(DNMTl、DNMT3A、DNMT3B)表達水平與LFA-1亞基CDlla表達水平的相互關

4、系;2)DNMT表達水平與SLE嚴重程度的相互關系,發(fā)現(xiàn)SLE患者PBMC中DNMTl表達顯著低于對照組,活動期DNMTl表達水平略低于緩解期.對照組、SLE緩解期與活動期患者PBMC中DNMT3A表達沒有明顯差異,DNMT3B極少表達.SLE緩解期和活動期PBMC中CDlla表達明顯高于對照組,活動期CDlla表達明顯高于緩解期,CDlla表達的升高與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE-DAI)呈顯著的正相關.CDlla表達水平與DNMTl表達水

5、平之間呈負相關傾向,但不顯著.DNMTl表達水平的降低及CDlla表達的升高在SLE的發(fā)病中可能存在重要價值. 2.通過分析比較中國人SLE患者DNMTl部分外顯子exonl-exon7及相應內含子(intron)DNA序列與正常人的異同,發(fā)現(xiàn)中國人SLE患者中DNMTl外顯子Exon7與Exon8之間Intron7存在21397位t→c(胸腺嘧啶→胞嘧啶)的轉換, 8/11例患者顯示t→c改變,僅3/12例正常人顯示t→c改變

6、,卡方檢驗差異顯著.不同于國外的DNA甲基轉移酶及甲基胞嘧啶結合蛋白對系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的影響研究發(fā)現(xiàn),Exon4未發(fā)現(xiàn)g→c的改變.其它外顯子也未見特征性的改變.這種單核苷酸多態(tài)性(SNP)改變可能影響DNMTs活性,進而影響DNA甲基化狀態(tài). 3.通過檢測PBMC中甲基結合蛋白MeCP2及去甲基化酶MBD2的基因表達水平,分析1)兩者表達水平與LFA-1亞基CDlla表達水平的相互關系;2)兩者表達水平與SLE嚴重程度的相互

7、關系.發(fā)現(xiàn)MeCP2表達水平在對照組、SLE緩解期與活動期之間差異并沒有顯著性.SLE緩解期與活動期患者中MBD2轉錄水平則非常顯著地高于正常對照,MBD2轉錄水平與SLE-DAI呈非常顯著的正相關關系和線性回歸關系,且MBD2轉錄水平還與CDlla表達水平呈非常顯著的正相關關系和線性回歸關系.SLE中的低甲基水平又使得高水平MBD2的結合量顯著減少,靜默作用減弱甚至消失.MBD2/DNMTl值與SLE-DAl分值的相關性研究顯示顯著的

8、正相關和線性回歸關系,能夠較好地反映SLE發(fā)病中甲基化和去甲基化機制的雙重影響. 4.通過檢測MBD2、Gata3和IL4表達的量化關系,探索SLE中MBD2和Gata3表達水平對SLE中Th2異常分化的影響.發(fā)現(xiàn)SLE中Gata3、MBD2和IL4的表達水平皆顯著地高于正常對照組.正常人Gata3表達水平與IL4的表達水平呈顯著的相關性和線性回歸關系,但這種相關和線性回歸關系在SLE患者中消失了.SLE患者Gata3表達水平與

9、刀L4表達水平雖然相關性不顯著,仍呈正性傾向.MBD2表達水平與IL4表達水平相關性不顯著,呈負性傾向.結果提示: 1.SLE患者PBMC中DNMT1表達降低可能導致DNA甲基化水平降低,使得包括CDlla在內的多種基因過度表達,從而促進SLE發(fā)病;DNMT3A和DNMT3B表達低下使重頭作用型甲基轉移酶不能及時修復,半甲基化的單鏈更少,使以半甲基化單鏈為基礎的DNMT1失去了作用點,低甲基化處于幾乎不可修復狀態(tài);SLE中CDl

10、la表達明顯升高并與 SLE-DAI 呈顯著的正相關提示存在DNMT1降低-甲基化降低-LFA-1合成增加-SLE發(fā)病的機制;DNA低甲基化可能不是由低:DNMT1單一因素決定的,存在多個影響因素共同協(xié)同作用. 2.中國人SLE患者中DNMT1 intron 7存在21397位t→c的轉換可能影響編碼子構成,導致DNMT1三維構型的變化,進而減弱酶的活性. 3. 即使MeCP2的表達保持在相對穩(wěn)定的水平,SLE患者中DN

11、A甲基化程度的降低也同樣使由MeCP2介導的轉錄抑制減少;SLE中MBD2轉錄水平的顯著升高、與SLE-DAI呈非常顯著的正相關關系和線性回歸且與CDlla表達水平呈非常顯著的正相關關系和線性回歸,提示MBD2作為一種去甲基化酶在SLE的低甲基化狀態(tài)形成中至關重要,加速了基因激活;SLE中的低甲基化水平還使得MBD2結合量顯著減少,表達靜默作用減弱甚至消失.這種激活加強和靜默減弱聯(lián)合作用進一步促進了基因的表達,最終導致 LFA-1表達增

12、加和SLE活動;MBD2/DNMT1值與SLE-DA1分值顯著的正相關和線性回歸關系反映了SLE發(fā)病中甲基化和去甲基化機制的雙重影響. 4.正常和穩(wěn)定的基因調控背景下IL4的表達直接受到Gata3水平的作用,但這種相關和線性回歸關系在SLE患者中消失了,提示可能存在某些中間環(huán)節(jié)的缺損,使SLE中正常的基因調控背景發(fā)生改變,干擾Gata3-IL4激活機制的實現(xiàn).SLE患者Gata3表達水平與IL4表達水平的正性傾向提示患者中IL4

13、表達可能受到Gata3表達水平的正性影響;MBD2表達水平與IL4表達水平的負性傾向提示MBD2對IL4表達可能存在抑制傾向. 總之,DNA甲基轉移酶和去甲基酶表達水平在SLE中啟動子區(qū)CpG基序的甲基化狀態(tài)起到重要作用;SLE中基因緘默的打破不僅依賴于啟動子區(qū)域甲基化程度,而且還依賴于低甲基化造成的MBP結合降低,MBP的表達阻遏作用消失;低甲基化不僅使MBP的阻遏作用缺失,可能還影響到MBD2與Gata3的競爭作用,失去對I