大鼠Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯模型中慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾抑制心室肌KCNJ2基因表達(dá)對心室率影響的研究.pdf

1、研究背景:
　　人工電子心臟起搏器(cardiac pacemaker)作為治療某些心律失常（主要是緩慢性心律失常）時(shí)首選的治療儀器，是通過一種植入于人體內(nèi)的電子脈沖發(fā)生器發(fā)放電脈沖，進(jìn)而使與電極所接觸的心肌細(xì)胞產(chǎn)生有節(jié)律的沖動(dòng)，使心臟在此節(jié)律下有規(guī)律的激動(dòng)和收縮，從而達(dá)到治療的目的。自從1958年Rune Elmqvist成功將制造出的第一臺(tái)人工心臟起搏器植入到患者體內(nèi)至今，在緩慢型心律失常（如病竇綜合征和重度房室傳導(dǎo)阻滯等）治

2、療方面，人工起搏器已經(jīng)被公認(rèn)為首選的治療方法。不過在人們的應(yīng)用過程中，人工起搏器自身存在的一些缺陷及問題不斷暴露出來，其中比較嚴(yán)重的包括:電極易于發(fā)生斷裂、外來植入物可能導(dǎo)致感染、靜脈內(nèi)血栓形成而導(dǎo)致的栓塞、電池維持時(shí)間有限需重新進(jìn)行手術(shù)更換等。除此之外，對于特殊患者特別是兒童而言，隨著患兒的不斷成長和發(fā)育，早先所安裝的起搏器會(huì)逐漸無法滿足機(jī)體的需要，因此大多需要進(jìn)行重新更換，這都限制了它在某些特定患者中的應(yīng)用。
　　近些年隨著分

3、子生物學(xué)的發(fā)展，為了克服人工起搏器所存在的以上問題，有學(xué)者提出了生物起搏器的概念并被寄予厚望。目前，構(gòu)建生物起搏器的方法主要包括細(xì)胞治療和基因治療兩大方向，但是因?yàn)榧?xì)胞治療存在的一些問題如:倫理問題、成瘤問題、免疫排斥問題以及效果欠佳等，限制了其在這一領(lǐng)域的應(yīng)用。而通過基因治療構(gòu)建心臟生物起搏器卻越來越引起相關(guān)研究者的重視，現(xiàn)在基因治療主要包括以下三種方式:(1)通過過度表達(dá)β2腎上腺素受體基因來增加心房的電活動(dòng);(2)過度表達(dá)或移植人

4、工制造的工程化起搏電流(HCN2)基因來構(gòu)建起搏細(xì)胞;(3)通過基因技術(shù)抑制內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)，引起心肌細(xì)胞鉀電流的平衡發(fā)生變化，進(jìn)而使無起搏活性的心肌細(xì)胞產(chǎn)生自律性。
　　心肌是由心肌細(xì)胞構(gòu)成的一種肌肉組織，廣義上說，除了包括我們熟悉的具有收縮功能的工作細(xì)胞心房肌和心室肌以外，還包括無收縮功能的竇房結(jié)、結(jié)間束、房室交界部、房室束（即希斯束）和浦肯野纖維等5種特殊分化了的心肌細(xì)胞。后5種心肌細(xì)胞沒有收縮功能，但是具有自律性和

5、傳導(dǎo)性，它們共同組成心臟的起搏和傳導(dǎo)系統(tǒng)，是心臟能夠進(jìn)行自律性活動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);前兩種心肌細(xì)胞具有收縮性，是心臟舒縮活動(dòng)的功能基礎(chǔ)。早期研究發(fā)現(xiàn)，成人心室肌細(xì)胞有潛在的起搏活性;另外在心肌Ik1中KCNJ2基因所編碼的通道蛋白Kir2.1占80％左右，它可以使成人心室肌細(xì)胞的靜息膜電位保持在負(fù)電位水平，而且它高度表達(dá)于沒有自律性的心房肌和心室肌中，而在竇房結(jié)等具備自律性的細(xì)胞中表達(dá)卻相對罕見或缺乏。因此有學(xué)者認(rèn)為，由于受到Ik1的影響，心

6、室肌的起搏活性才會(huì)被抑制。以上觀點(diǎn)在后期的實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)，其中在SilvaJ等的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對心室肌細(xì)胞的Ik1電流的抑制率達(dá)到81％以后，其潛在的起搏活性就會(huì)顯現(xiàn)出來，出現(xiàn)自發(fā)的動(dòng)作電位，而且其自發(fā)的搏動(dòng)頻率會(huì)隨著Ik1電流抑制率的增加而相應(yīng)的提高。而Miake等則應(yīng)用基因工程構(gòu)造出編碼沒有功能、非活性的IK1通道的Kir2.1AAA基因，通過負(fù)顯性法來抑制心室肌細(xì)胞的Ik1電流。研究中他們發(fā)現(xiàn)在沒有對豚鼠心臟正常興奮性進(jìn)行負(fù)性干

7、預(yù)的前提下，成功的誘導(dǎo)出了起源于豚鼠心室肌細(xì)胞的自發(fā)起搏活動(dòng)，而且經(jīng)過檢測此起搏活動(dòng)的頻率比竇房結(jié)的正常頻率還要快，被認(rèn)為是世界上首例成功構(gòu)建的生物心臟起搏器。另外，有研究者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，如果將心肌細(xì)胞中KCNJ2基因的表達(dá)完全阻斷，會(huì)導(dǎo)致多種心律失常的出現(xiàn)。ChanYC等進(jìn)一步的研究則發(fā)現(xiàn)，在生物起搏器的基因治療中抑制Kir2.1蛋白表達(dá)與過表達(dá)HCN4基因有協(xié)同作用，可以共同提高心肌細(xì)胞的自律性。近期，位于美國的Cedars-

8、Sinai心臟研究所的KapoorN等通過向普通心肌細(xì)胞中注入單個(gè)Tbx18基因?qū)ζ溥M(jìn)行重新編程，將心肌細(xì)胞改造成專業(yè)化很高的“生物起搏器”的實(shí)驗(yàn)獲得了成功，另外他們還發(fā)現(xiàn)改造后的心肌細(xì)胞所產(chǎn)生的電活動(dòng)，可以規(guī)律的傳導(dǎo)至全部心肌細(xì)胞，引起心臟出現(xiàn)有節(jié)奏的舒縮，證實(shí)了通過植入單個(gè)基因即可以將心肌細(xì)胞改造成專門的起搏細(xì)胞，并且通過心室的這個(gè)起搏點(diǎn)能夠引起心臟出現(xiàn)規(guī)律的肌肉活動(dòng)。這一事實(shí)進(jìn)一步為通過提高局部心室肌細(xì)胞自律性來在體構(gòu)建生物起搏器

9、提供了依據(jù)。
　　RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是目前比較成熟的一種基因干預(yù)技術(shù)，是由雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)的同源mRNA降解的過程[14，15]。能夠達(dá)到在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上特異性阻斷基因表達(dá)的效果。目前人們已經(jīng)掌握了根據(jù)RNA干擾的原理人工合成siRNAs(small interference RNA)的技術(shù)，為通過使用能表達(dá)siRNAs的載體在體外或體內(nèi)誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞產(chǎn)生

10、特異的基因沉默提供了技術(shù)支持。
　　慢病毒載體(Lentiviral vector,LVs)是在人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基礎(chǔ)上改造而成的，能利用逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，將自身的RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA整合到宿主細(xì)胞的染色體中，從而使目的基因在宿主細(xì)胞中長期而穩(wěn)定的表達(dá)。因?yàn)槠渚哂兴拗鞣秶鷱V，所能容納的外源性基因片段大，安全性高等優(yōu)點(diǎn)，目前在基因治療中的應(yīng)用越來越廣泛。
　　前期本課題組已經(jīng)獲得了干擾KCNJ2基因mRNA的特異位

11、點(diǎn)(+361～+379堿基)，并且通過應(yīng)用設(shè)計(jì)出的特異干擾序列，在細(xì)胞水平證實(shí)了將RNA干擾基因?qū)胄氖壹〖?xì)胞，使其產(chǎn)生干擾效應(yīng)，特異性得使KCNJ2基因沉默，抑制內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)，進(jìn)而誘導(dǎo)處于靜息狀態(tài)的心室肌細(xì)胞產(chǎn)生生物起搏活性的可行性。
　　在本課題中，我們將在動(dòng)物體內(nèi)通過干擾KCNJ2基因來抑制模型大鼠心肌的內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)，探討是否可以提高模型大鼠的心室率。在實(shí)驗(yàn)中我們通過建立大鼠Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯的模型，消

12、除竇性起搏對心室肌細(xì)胞自律性的掩蓋;進(jìn)而應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，通過干擾KCNJ2基因從而抑制Kir2.1蛋白，達(dá)到抑制內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)通道的目的，觀察模型大鼠心室率的變化情況來探討以上假設(shè)的可行性。希望可以為生物起搏器的體內(nèi)研究提供一些有價(jià)值的試驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分:攜帶有特異性干擾片段的慢病毒載體的構(gòu)建
　　研究目的:
　　制備含有針對大鼠心肌細(xì)胞KCNJ2基因mRNA的特異性shRNA的慢病毒

13、表達(dá)載體。
　　研究方法:
　　1、將前期驗(yàn)證的對KCNJ2基因mRNA上沉默效果最明顯的干擾片斷以MluI，ClaI為插入位點(diǎn)，插入到由H1啟動(dòng)子調(diào)控以及有GFP表達(dá)的慢病毒載體中;并通過MluI，ClaI雙酶切技術(shù)進(jìn)行鑒定。
　　2、在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下將混合的慢病毒載體包裝質(zhì)粒和包含KCNJ2基因干擾片段的重組慢病毒載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝成病毒，72小時(shí)后收集上清，應(yīng)用逐孔稀釋滴度測定法測定病毒滴度。
　

14、　研究結(jié)果:
　　通過雙酶切電泳證實(shí)所設(shè)計(jì)的KCNJ2基因shRNA正確插入到了慢病毒載體中，DNA測序證實(shí)插入的序列正確;293T細(xì)胞成功包裝重組慢病毒載體;收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，病毒的滴度為1.07×109TU/ml。
　　結(jié)論:
　　制備的慢病毒載體構(gòu)建成功，同時(shí)獲得的病毒滴度較高，完全滿足后續(xù)在體實(shí)驗(yàn)的要求。
　　第二部分:在大鼠Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯模型中抑制心室肌KCNJ2基因的表達(dá)對心室率的影響

15、　　研究目的:
　　1、建立穩(wěn)定的大鼠Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯的模型。
　　2、確定慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠的最佳滴度。
　　3、明確慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯模型后心室率的變化情況。
　　4、明確慢病毒載體轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后KCNJ2基因mRNA和Kir2.1蛋白表達(dá)的變化及其于大鼠心室率的關(guān)系。
　　研究方法:
　　1、采用定點(diǎn)注射70％乙醇的方法破壞大鼠的房室結(jié)，使大鼠發(fā)生Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯。注射乙醇約25

16、ul，觀察心電圖變化，出現(xiàn)Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯的大鼠觀察30分鐘，待穩(wěn)定后關(guān)胸，72小時(shí)后檢測確定建模是否成功。
　　2、取正常大鼠給予不同滴度的空白慢病毒載體30ul進(jìn)行心肌注射，分別取注射后第4天、7天、10天處死取材，迅速制作冰凍切片，在免疫熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測，根據(jù)各不同時(shí)段切片中的綠色熒光蛋白的亮度，確定轉(zhuǎn)染效率與病毒滴度的關(guān)系，用轉(zhuǎn)染效率最高的滴度進(jìn)行模型大鼠的注射。
　　3、將建立的模型大鼠分為對照組、空載體組、病

17、毒干預(yù)組三組;其中對照組只進(jìn)行轉(zhuǎn)染的手術(shù)操作但不進(jìn)行相應(yīng)的病毒轉(zhuǎn)染;另兩組則分別轉(zhuǎn)染慢病毒空載體及攜帶有相應(yīng)shRNA的慢病毒載體。轉(zhuǎn)染后分別于不同時(shí)間點(diǎn)通過心電圖檢測各組大鼠心室率的變化情況。
　　4、分別對各組所取得的心肌組織進(jìn)行相應(yīng)處理，通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測KCNJ2基因的表達(dá)情況;應(yīng)用Western-blot及免疫組化檢測心肌組織中kir2.1蛋白的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:
　　1、建立了持久、穩(wěn)

18、定的Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯大鼠模型，滿足本實(shí)驗(yàn)的要求。
　　2、慢病毒的最佳轉(zhuǎn)染滴度為109TU/ml，轉(zhuǎn)染7天后轉(zhuǎn)染效率變穩(wěn)定。
　　3、本研究發(fā)現(xiàn)病毒干預(yù)組中有54.5％的大鼠心室率由156±6次/分鐘提高到218±10次/分鐘，差異性顯著(p＜0.01);進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)心室率的提高與KCNJ2基因、Kir2.1蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);是由慢病毒轉(zhuǎn)染的基因沉默引起的，且在轉(zhuǎn)染后14天，當(dāng)KCNJ2基因與Kir2.1蛋白抑制率分別為