白血病細(xì)胞檢查的演進(jìn)教學(xué)

1、白血病細(xì)胞檢查的演進(jìn),形態(tài)學(xué)（M）（組織化學(xué)）、免疫表型（I）、細(xì)胞遺傳學(xué)（C）、分子生物學(xué)（M）的發(fā)展過程。MICMG（基因） 的可能。一. 形態(tài)學(xué)（一）歷史回顧17世紀(jì)顯微鏡1880 Ehrlich細(xì)胞染色法Wright，Giemsa1890原粒，1910巨核，血小板,功能形態(tài)活體染色細(xì)胞化學(xué) 活體 中性粒活潑地活動(dòng)線粒體（原始細(xì)胞多） 組化核酸，RNA，糖原（PAS） 脂質(zhì)（蘇丹

2、黑），酶（POX，非特異性酯酶）二次世戰(zhàn)后 50年代位相顯微鏡（立體） 透視電鏡，功能與形態(tài)結(jié)合；熒光顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡,1944Blackman小兒血液圖譜1949Custer血液和骨髓圖譜1954Bessis血細(xì)胞電鏡1950解放初實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)講義，上醫(yī)1965徐福燕臨床血液細(xì)胞學(xué)1967沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院血液和細(xì)胞學(xué)圖譜,熊樹民: 血液腫瘤骨髓診斷圖譜,上

3、海科技 出 版社 2003 結(jié)合WHO分型姬美容:臨床疑難血液病細(xì)胞形態(tài)診斷精要, 上?？萍嘉墨I(xiàn)出 版社,2002浦權(quán):血液病骨髓組織病理學(xué)彩色圖譜,上?？萍嘉墨I(xiàn)出 版社,2000,1976FAB分型法1985修訂補(bǔ)充提出AL FAB分型診斷標(biāo)準(zhǔn)1980全國(guó)白血病分類分型建議1986 AL分型的形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn) MIC 分型2001 WHO 分型

4、 髓系及淋系惡性增生性疾病的分類,髓細(xì)胞系統(tǒng)惡性增生性疾病1.骨髓增生性疾病MPD 慢性粒細(xì)胞性白血病(CML) 真紅 原發(fā)性血小板增多癥 原纖2.骨髓增生異常綜合征(MDS) RA,RAS,RAEB,RAEBT3. MPD/MDS4. 急性髓細(xì)胞白血病 M1~7,其他,淋巴系統(tǒng)增生性疾病 一.免疫性或反應(yīng)性淋巴增生性疾病- 非典型淋巴增生(A

5、IL) ? 病毒 病毒相關(guān)AIL,EBV 引起的傳單,MCV,HIV,HTL-1, SARS,HHV8等 ?移植后淋巴增生性疾病(PTLD) ?藥物 免疫抑制劑,有的與EBV 有關(guān), 有的不明 ?自身免疫性疾病 類風(fēng)關(guān),干燥綜合征,發(fā)生淋巴增生、惡性變 的危險(xiǎn)性較正常人群高40倍正常人高,可達(dá)40倍,?遺傳性免疫缺陷 ?原因不明的不典型淋巴增生 * C

6、astleman 病 病毒（HHV8)引起,有漿細(xì)胞增生, 高球蛋白血癥, IC 病的表現(xiàn)(血管、腎臟等）,組織細(xì)胞性壞死性淋巴結(jié)炎?壞死性淋巴結(jié)炎,病毒性淋巴結(jié)炎.Kikuchi (菊池) 病,1970年報(bào)道.多見于東方人(日本、中國(guó)）?發(fā)生在青壯年，女稍多于男?發(fā)熱，頸部淋巴結(jié)腫大，可有痛，白細(xì)胞增高或減少，外周血中有異形淋巴細(xì)胞。 淋巴結(jié)活檢，淋巴結(jié)中可見組織細(xì)胞增多， CD8+T 細(xì)胞，有壞死灶?抗生素治療無

7、效。病程數(shù)周至數(shù)月。激素可退熱,,?基因突變-FAS突變引起的自身免疫 淋巴增生綜合征(ALPS)*1967年初次報(bào)導(dǎo),又名Canale-Smith綜合征*常染色體顯性遺傳,外顯率不一.大多發(fā)生在兒童,成人也可發(fā)病*肝、脾、淋巴結(jié)腫大，血液中淋巴細(xì)胞增多，生存期延長(zhǎng)*自身免疫性溶貧,血小板減低少,粒細(xì)胞減少*淋巴細(xì)胞上FAS基因突變，凋亡受阻?？裳葑?yōu)榱馨土?二.惡性增生性疾病 1.急慢性淋巴

8、細(xì)胞性白血病 多毛細(xì)胞性白血病 大顆粒淋巴細(xì)胞白血病 NK 細(xì)胞白血病 間變大細(xì)胞白血病 惡性組織細(xì)胞增生癥 2.惡性淋巴瘤 WHO 分型(2001) 霍奇金病 B、T 、NK 細(xì)胞淋巴瘤,,T細(xì)胞和NK細(xì)胞腫瘤前體T細(xì)胞腫瘤 前體T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤/白血?。═-LBL/

9、ALL）成熟（周圍）T細(xì)胞腫瘤 T-細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血?。═-PLL） T-大顆粒淋巴細(xì)胞白血?。═-LGL） 侵襲性NK細(xì)胞白血病（ANKCL） 成人T細(xì)胞淋巴瘤/白血?。ˋTCL/L） 結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤，鼻型（NK/TCL） 腸病型T細(xì)胞/淋巴瘤（ITCL） 肝脾γδT細(xì)胞淋巴瘤 皮下脂膜炎樣T細(xì)胞淋巴瘤 蕈樣真菌病/Sezary綜合征（MF/SS）

10、間變性大細(xì)胞淋巴瘤（ALCL）,,,,B細(xì)胞腫瘤 前體B細(xì)胞腫瘤 前體B淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤（B-ALL/LBL） 成熟（周圍）B細(xì)胞腫瘤 B-慢性淋巴細(xì)胞性白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤（B-CLL/SLL） B-細(xì)胞幼淋巴性細(xì)胞白血病（B-PLL） 淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤（LPL） Burkitt淋巴瘤（BL） 多

11、毛細(xì)胞白血病（HCL） 漿細(xì)胞骨髓瘤/漿細(xì)胞瘤（PCM/PCL） 脾邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤，±絨毛狀淋巴細(xì)胞（SMZL） 結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤，MALT型（MALT-MZL） 結(jié)型邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤，±單核細(xì)胞樣B細(xì)胞（MZL） 濾泡性淋巴瘤（FL） 套細(xì)胞淋巴瘤（MCL） 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤

12、（DLBCL）,,,,淋巴瘤侵犯外周血或/和骨髓淋巴瘤類型 外周血 % 骨髓%T-ALL/淋巴瘤 成人TALL/淋巴瘤 前B細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋巴瘤/白血病 80CLL/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL) 1/3(SLL)淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤

13、 46~49濾泡性淋巴瘤 24邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤 ± 絨毛淋巴細(xì)胞 10~44Burkitt淋巴瘤

14、 20套細(xì)胞淋巴瘤 20~80彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤 10~15間變性大淋巴細(xì)胞淋巴瘤

15、 30,,,,(一)形態(tài)學(xué)檢查 Wright, Giemsa 染色,組化, 電鏡,急非淋白血病,組化 Ml M2 M3 M4 M5 M6 M7POX + ++ ++ ++ ?

16、 ? -蘇丹黑 + + + + ? ? -酯酶 + + + ++ ++ + +氟化鈉抑制 部分 部分 部分 部分 抑制 不抑制PAS - -

17、 - - - + +,,,,,細(xì)胞形態(tài)學(xué)及組化檢查舉例,原 始 細(xì) 胞,原粒細(xì)胞過氧化物酶染色陽(yáng)性,原單核細(xì)胞 糖原染色陽(yáng)性,原單核細(xì)胞非特異性酯酶染色 氟化鈉抑制試驗(yàn),早幼粒細(xì)胞 特異性酯酶染色陽(yáng)性,AMOL透射電鏡,AMOL掃描電鏡,CML-AKP染色,,,,,伴絨毛淋巴細(xì)胞脾性淋巴瘤 (Parry-Jones N Br J Haemat

18、ol 2003,123:370)N=129 年齡中位 69 (39-90) 男:女 0.9臨床特點(diǎn): 脾大. 臨巴結(jié)及肝腫大少見 白細(xì)胞 1600,血小板 145000, Hb 11.8gm轉(zhuǎn)歸: 27% 不治, 10% 轉(zhuǎn)變?yōu)楦呶Ａ馨土?中位生存期 13 年 治療: 脾切除有效,,HCL 骨髓象,HCL骨髓象,,ALL透射電鏡,ALL-掃描電鏡,多毛細(xì)胞白血病透射電鏡,HCL ACP染色

19、 +酒石酸鹽,,T-LGL 血象,T-LGL血象,,大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)增生四種類型 CD3,CD4,CD8,TCRαβ,γδ +,CD56、CD57+1.反應(yīng)性一過性增生 繼發(fā)于感染,如結(jié)核等,逆轉(zhuǎn)錄病毒、HTLV-1感染活化T細(xì)胞導(dǎo)致(克隆性)增生2.慢性LGL增生,34%血液中有自身抗體,IgG,CIC增高,類風(fēng)濕因子2%陽(yáng)性, 病程可達(dá)4年3.惰性LGL白血病 大多發(fā)生在老年人,30~4

20、0%無臨床表現(xiàn),但有粒細(xì)胞減少、貧血、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，MTX，環(huán)孢素，CTX治療有效4.侵襲性LGL白血病 病程短,預(yù)后差,激光掃描共聚焦顯微鏡最先進(jìn)的分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀之一,測(cè)定物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位,如鈣離子,兩種物質(zhì)是否在同一部位,血細(xì)胞形態(tài)學(xué)及增生情況檢查的重要性,1.意義血細(xì)胞形態(tài)血檢查仍是血液病診 斷的基礎(chǔ),意義2.骨髓增生情況與預(yù)后

21、 (516 例AML) 増生程度 CR% 中位生存 1+ 76 2+ 67 1+2+ 23M 3+ 73 4+

22、 60 3+4+ 14M,,,,二.免疫表型*方法 用單抗標(biāo)記免疫熒光*表達(dá)方法 以CD+%表達(dá), CD=分化抗原叢 CD >166,T細(xì)胞的免疫表型 胸腺祖細(xì)胞 胸腺細(xì)胞 成熟T細(xì)胞 CD1

23、 +CD2 + +CD3

24、 +cCD3 + +CD4 + +CD5

25、 + +CD6 +CD7 + + +CD8

26、 + +TdT + +,,,,抗原 早期前B 前B 過渡B 未成熟B 成熟B 漿細(xì)胞TdT?鏈重排?鏈重排?鏈重排 cIg sIg

27、HLA-DRCD10CD19CD20CD21CD22CD23CD24CD38 ?CD34 +(祖細(xì)胞),,,,,,,,,,,,,,,,,(一)急性白血病的免疫學(xué)分型淋巴 CD3

28、，CD4，CD5,CD8，CD2，CD7， T細(xì)胞 CD19，CD20，CD21，CD22， B細(xì)胞髓單細(xì)胞 MPO,CD13，14，15, CD33造血前體細(xì)胞 CD34巨核血小板 CD41，42,AML-CD33(+),ALL-CD19(+),AM

29、L-MPO(+),ALL-CD20(+),,MAL 螢光標(biāo)記 ：黃（CD19 ）紅（CD13）,(二)免疫學(xué)分型的意義補(bǔ)充形態(tài)學(xué)檢查的不足、證實(shí)(1)髓系 補(bǔ)充,證實(shí),有無淋系CD表達(dá)(2)淋系:分T、B，急性B淋巴細(xì)胞白血病，前體（無標(biāo) 記），普通型 前B細(xì)胞型和B細(xì)胞型，區(qū)分有些亞型,FAB 分型,AML Mo,M1,M2,M3,M4,M4Eo M5a,M5b, M6,M7ALL

30、 L1,L2,L3 FAB L1 25% 屬T;75%屬B;早期前B 前B 90%;10%B(T:B=1:3) FAB L3 75%屬B FAB L2 5%屬T; T:B=1:20;10%早期 B;15%B,10%前B,B-ALL 的免疫表型,類型 H

31、LA-DR CD19 CD10 CD22 CD20 CY Sm IgM Ig無標(biāo)記型 + -/+ - - - - -普通型

32、 + + + ? ? - -前 B + + + + + + - B ALL + + +/ -

33、 + + - +,,,,慢性B淋巴系白血病分型抗原HLA-DRCD5CD19CD20CD21CD22CD23CD25CLL + + + + + + + -HCL + - + + - + - PLL

34、 + - + + + + - -,,,,*大顆粒淋巴細(xì)胞性白血病 CD3+,CD57+ T細(xì)胞 85% CD3-/CD56+ NK細(xì)胞 15%*慢性LGL淋巴細(xì)胞增生 CD56- 或CD56+dim CD11b(-/+dim), CD7(-/+dim), CD2+, CD11c,CD38(

35、-/+dim)*間變性大細(xì)胞淋巴瘤合并白血病 CD30(Ki-1)+ *惡組 反映單核-巨噬細(xì)胞免疫表型 CD11c,CD14,CD33,CD45,CD68+,2. 與預(yù)后的關(guān)系（1）AML表型越不成熟，預(yù)后越差，表達(dá)淋系(雙表型)預(yù)后差 AML CD7大多M1，多見于青壯年，外周血中原始、幼稚細(xì)胞較高，化療反應(yīng)差,AMLo POX(一) 淋、巨核表型（一）預(yù)后差（2）

36、ALL 普通型CD19+ CD10+預(yù)后好 成人ALL若表達(dá)髓系抗原，CR較低,成人T-ALL 亞型比較(658 例) 前T-ALL 成熟T-ALL 免疫表型 CD1, CD7 CD3 發(fā)生率 19%

37、 81% CR 71% 90% 治療失敗 9% 5% 5年生存率 42% 46% 12年生存率 39%

38、 46%,,,,AML 202 例,用21種單抗檢測(cè)(M3除外) 表達(dá)全髓抗原 <四種 (MPO,CD13,CD33 CDW65, CD117) CR率 81%

39、 48% OS(中位) 780天 190天 48% 17% 病人年齡較輕,耐藥較少,,,,3. 指導(dǎo)治療 預(yù)后差的表型化療強(qiáng)些或早期BMT成人ALL誘導(dǎo)緩解（根據(jù)

40、分型）分型方案及效果L3傳統(tǒng)方案 CR30-40%加HD-Ara-C，CTXCR可達(dá)70%-80%，5年DFS 50%前B及T加大劑量Ara-C+MTX,,,,三. 染色體(C)檢查(一)檢查方法的進(jìn)展 非顯帶(70年代前)，G帶、Q帶、R帶顯色（80年代），熒光原位雜交（FISH）（90年代）、 多色FISH?用于白血病及淋巴瘤的檢查 急淋 60~90% 異常，6

41、0%左右特異性改變 數(shù)目異常、缺失、移位、重排 慢性淋巴增生性疾病 CLL 20~50% 毛細(xì)胞白血病 20%. MM 50~70%，慢性T40~50%， 成人T 25% 淋巴瘤 HL 1/3，NHL 80% 有克隆性染色體異常,分子遺傳學(xué)新技術(shù) 熒光原位雜交(FISH) 比較基因組雜交(CGH) 多色素FISH 光譜

42、核型分析 Rx-FISH-篩選技術(shù),,,,,,,,,,,,,,,Chr4,R帶,Chr12,,chr4,,chr12,,der12,,der4,02-042,(二)意義 1.診斷 用于白血病的檢查 急淋 60~90% 異常，60%左右特異性改變,數(shù)目異常、缺失、移位、重排 慢性淋巴增生性疾病 CLL 20~50% 毛細(xì)胞白血病 20%. MM

43、50~70%，慢性T40~50%， 成人T 25% 淋巴瘤 HL 1/3，NHL 80% 有克隆性染色體異常 特異性異常: t(9;22) 慢粒 t(15;17) M3 t(8;21) M2b in(16) M4EO

44、 2. 危險(xiǎn)性高低之分?低危 伴t(15;17), t(8;21), inv(16)?高危 5q，7q缺失，單倍體，3號(hào)染色體易位 或倒位，t(6;9)，t(9;22)? 中危 11q23異常,t(4;11),,AML危險(xiǎn)程度與CR及5年OS,危險(xiǎn)程度染色體改變CR%5年存活% 高伴t(9;22), -5-7, 3

45、q異常56-6312-26t(9;11)t(4;11), 復(fù)合 中正常+8, +2170-8635-41+22, 11q23異常 低t(8;21), in(16)84-9156-84t(15;17),,,,成人ALL的免疫分型亞型 主要表達(dá)的CD 發(fā)生率% 常見染色體改變B 系 HLA-DR+,TDT+

46、CD19+ 76 早B CD10- 11 t(4;11) 普通 CD10+ 51 t(9;22),9p、12p aber

47、 多倍體 前B CD10±，CyIgM+ 10 t(1;19),7(9;22),多倍體 成熟B CD10±，TdT±,sIgM+ 4 t

48、(8;14),t(8;22),t(2;8)T系 TdT+,cyCD3+,CD7+ 早T CD2-,sCD3-,CD1a- 6 t(11;14) 胸T sCD3 ±,CD1a+ 12 t(10;14) 成熟T sCD3+,C

49、D1a- 5 9q aberr,,,,3.發(fā)現(xiàn)新的急性白血病亞型M3 t(11;17)等M2 t(8;19)4. 治療效果不同,成人B-ALL 340 例核型與預(yù)后核型 t(12;21) 多倍體 無高危 t(9;22)

50、 或無異常 t(4;11)例數(shù) 82 106 134 285年EFS 86% 78% 68% 40%5年0S 100% 93% 81% 28%,,,,AML危險(xiǎn)程度與CR及5

51、年OS,危險(xiǎn)程度染色體改變CR%5年存活% 高伴t(9;22), -5-7, 3q異常56-6312-26t(9;11)t(4;11), 復(fù)合 中正常+8, +2170-8635-41+22, 11q23異常 低t(8;21), in(16)84-9156-84t(15;17),,,,各型AML預(yù)后FAB分型

52、染色體改變 nCR%中位生存（月） 5年生存%M2bt(8;21) 208 93>6067M4EOin(16)t(16;16) 92 891562M2, M4del(7q) 33 8260M1, M4-5q 36 5040M1, M2正常 650 711233M3t(15;17)806 92

53、84,,,,老年人AL 核型與預(yù)后 低危 高危 例數(shù) 11 13 核型 t( 8;21) -5/5q- t(15;17) -7/7q-

54、 inv(16) CR 64% 23% OS 6m 1m,,,,四. 分子生物學(xué)(M)檢查 方法發(fā)展很快,自動(dòng)化 (一)結(jié)果 t(11q) M4,M5 t(8;21) →AML1-ETO融合基因 t(9;22)→ BCR-AB

55、L融合基因 t(15;17)→PML-RARa,,,,(二)意義1。診斷與治療 補(bǔ)充MIC的不足,PH1-BCR-ABL+ 要達(dá)分子緩解,半定量,考貝數(shù) 如M3的PML-RARA,CML的BCR-ABL2. 預(yù)后 ALL若Ph1（+）、AML若高表達(dá)FLT3，RAS基因突變，則預(yù)后差3. 發(fā)病機(jī)制,具有再現(xiàn)性細(xì)胞遺傳學(xué)異常的AML (蘇醫(yī)153/329,46,

56、5%)WHO分型 例數(shù) FAB分型結(jié)果t(8;21) 或AML1/ETO 58 M1、M2、M3t(15;17)或PML/RARA 85 M2、M3Inv(16)或CBFβ/MYH11 4 M411q23或MLL 6

57、 M5,,,,329例AML的MIC分型(蘇醫(yī))(05)FAB n 特異性染色體或基因異常(例數(shù)) 異常% t(8;21) 7(15;17) inv/del(16) 11q23M1 41 3

58、 27M2 103 54 1 69M3 100 1 84 89M4 25

59、 44M4EO 6 4 67M5 50 6 44M6

60、 20,,,,對(duì)發(fā)病機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí) 累及基因 染色體部位 病型 影響功能 LCK t(1;7)(p34;q34) T-ALL 蛋

61、白激酶 TCR? 7q34 如t(7;9)(q34;q34.4) T-ALL T受體激 活 TCR?/ ? 14q11如t(14;14)(q11;q32) T-ALL HOX11 10q24 如t(10;14)(q24;q11)T-ALL t(7;10)(q34;q24

62、) T-ALL 干擾正常 T細(xì)胞調(diào)節(jié), 阻斷細(xì)胞凋亡 JAK2 12p13 如t(9;12)(p24;p13) T-ALL TK激活,,,,,ALL類型 染色體移位 受累基因B細(xì)胞系前B-ALL t(1

63、2;21)(p13;q22) TEL;AML前B-ALL t(4;11)(q21;q23) AF4;MLL(HRX)前B-ALL t(1 ;11)(p32;q23) AFIP;MLL前B-ALL t(6;11)(q27;q23) AF6;MLL前B-ALL t(11;19)(q23;p13)

64、 MLL;ENL/MEN前B-ALL t(1 ;19)(q23;P13) E2A-PBX1前B-ALL t(17 ;19)(q22;P13) HLF;E2A前B-CLL t(14 ;19)(q32;q13) IgH;BCL3前B-CLL/ALL t(8;12 )(q24;q22) MYC;BTG,,,,,4

65、.靶向藥物治療的靶點(diǎn)（1）ATRA,ATO 降解PML-RARA融合蛋白（2）格力衛(wèi) 抑制BCR-ABL的酪氨酸激酶(TK),治療CML,表達(dá)c-Kit 的白血病,PH1+的急性白血?。?）抗CD33 單抗接上裂解DNA的抗生素 Mylotarg 治療AML（4） FLT3抑制劑治療FLT3+的AML,,,,C-Kit 基因(CD117)的表達(dá) 類型 n

66、 陽(yáng)性例數(shù) % AML 151 102 68 ALL 158 3 2 CLL 5 0 0

67、 CML 4 0 0 CML急變 5 4 80,,,,*c-Kit基因中有酪氨酸激酶(TK),有 CD117 高表達(dá)的AML 用格力衛(wèi)治療可 以奏效 *CD33+的難治性AML用CD33單抗體上接上裂解DNA藥物(Myl

68、otarg),難治AML用Mylotarg(抗CD33單抗+）Year 報(bào)告者 n 有效率 CR % % 2002 Roboz 43

69、 14 9 AML,RAEBT2001 Sievers 142 30 2003 Sievers 277 26 age>60,首次復(fù)發(fā)2002 Larson 101 28 13

70、 age>60, median 5.4m2002 Leopold 188 -- 302003 Tsimberidou 59 46 +F,Ara-C,CT