bFGF對體外培養(yǎng)豚鼠LIM鞏膜成纖維細胞增殖，TGF-β2、FGFR-1表達及其對細胞力學特性影響的研究.pdf

1、目的：明確堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）對豚鼠鏡片誘導型近視眼（lens-in-duced myopia，LIM）后極部鞏膜成纖維細胞的增殖程度，轉(zhuǎn)化生長因子-β2（TGF-β2）、成纖維細胞生長因子受體-1（FGFR-1）表達變化的影響，并結合其對細胞力學特性的影響，從細胞因子和細胞力學的角度探討bFGF在近視眼的發(fā)病機制和治療中的作用。
　　 方法：2周齡豚鼠10只隨機選取一眼用鏡片誘導方法制備近視動物模型（實驗眼，LI

2、M），對側為自身對照（對照眼，SC）。造模45天，實驗前后均檢測每只豚鼠雙眼屈光狀態(tài)、眼軸長度。用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)豚鼠后極部鞏膜成纖維細胞，并傳2代。用免疫組織化學法對培養(yǎng)的細胞進行鑒定，再將每只眼培養(yǎng)的細胞分為A、B、C、D四組，分別為空白組、1ng/ml。bFGF組、10ng/ml bFGF組、100ng/ml bFGF組，利用MTT的方法檢測各組細胞增殖的程度；利用免疫組織化學法對各組細胞。TGF-β2、FGFR-1進行半定量分析

3、；利用細胞微管吸吮的方法結合半無限體細胞力學模型（Half=space model）測定各組鞏膜成纖維細胞的力學特性（包括成纖維細胞的楊氏彈性模量和粘彈性參數(shù)）。結果用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
　　 結果：
　　 1豚鼠實驗性近視的誘導結果
　　 鏡片誘導前豚鼠雙眼屈光度無明顯差異，經(jīng)過45天鏡片誘導，LIM組形成明顯近視，LIM組與SC組比較，誘導出-6.70±1.93D的相對近視，眼軸相對延長了

4、1.53±0.31mm，前后變化差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 2細胞培養(yǎng)及鑒定結果
　　 豚鼠后極部鞏膜組織塊培養(yǎng)3～5天，周圍開始有細胞長出，2～3周融合，免疫細胞化學鑒定為成纖維細胞。
　　 3 MTT結果
　　 MTT結果顯示：LIM組中B組與A組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），C、D.組和A組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），細胞數(shù)量分別增長24.9％、14.2％；SC組中B

5、組與A組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），C、D組和A組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），細胞數(shù)量分別增長27.4％、12.5％。在LIM組和SC組之間相同濃度的bFGF對細胞的促增生作用無明顯差異（P>0.05），但10ng/ml bFGF的濃度對細胞的刺激效果和100ng/ml bFGF濃度相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 4鞏膜成纖維細胞TGF-β2、FGFR-1的表達
　　 TGF-β2的表

6、達以細胞漿為主，核膜少許，LIM組中A組與SC組中A組比較，其著色程度增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。LIM組和SC組細胞隨著bFGF濃度的增高TGF-β2的表達變化無明顯統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 FGFR-1的表達以細胞漿為主，核膜少許，LIM組中A組與SC組中A組比較，其著色程度下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。LIM組和SC組細胞均隨著bFGF濃度的增高，F(xiàn)GFR-1染色程度越來越深。經(jīng)統(tǒng)計學分析細

7、胞染色程度和bFGF濃度有明顯的相關性，其相關系數(shù)分別為0.865、0.788。
　　 5細胞力學研究結果
　　 5.1對照組與實驗組后極部鞏膜成纖維細胞力學特性及統(tǒng)計學分析
　　 分別對SC組中A組與LIM組中A組鞏膜成纖維細胞進行測量，得到SC組中A組鞏膜成纖維細胞平衡楊氏模量E∝=0.2125±0.0526kPa，LIM組中A組鞏膜成纖維細胞平衡楊氏模量E∝=0.3041±0.4658kPa，經(jīng)統(tǒng)計學分析，

8、LIM組中A組鞏膜成纖維細胞的平衡楊氏模量明顯升高，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 對鞏膜成纖維細胞進行微管吸吮測試發(fā)現(xiàn)，在某一恒定負壓作用下，鞏膜成纖維細胞表現(xiàn)出典型的粘彈性固體蠕變特征。SC組中A組鞏膜成纖維細胞表觀黏性μ=2.8875±0.5138kPa.s，LIM組中。A組鞏膜成纖維細胞表觀黏性μ=5.4077±1.041kPa.s，統(tǒng)計學分析表明LIM組中A組鞏膜成纖維細胞的表觀黏性明顯升高，兩者之間

9、差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 5.2 bFGF對SC組與LIM組后極部鞏膜成纖維細胞力學特性的影響及統(tǒng)計學分析
　　 5.2.1 SC組在bFGF作用下，A組、B組、C組、D組平衡楊氏模量分別為：E∝=0.2125±0.0526kPa，E∝=0.2158±0.7753kPa，E∝=0.3340±1.062kPa，E∝=0.2963±0.0505kPa，其中B組與A組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），C組、

10、D組與A組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），經(jīng)統(tǒng)計學相關性分析，細胞的平衡楊氏模量與bFGF的濃度有明顯的相關性，其相關系數(shù)為：0.47。C組與D組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 5.2.2 SC組在bFGF作用下，A組、B組、C組、D組細胞表觀黏性分別為μ=2.8875±0.5138kPa.s，μ=2.1557±0.8327kPa.s，μ=4.9425±1.0011kPa.s，μ=3.7078±1.4479

11、kPa.s，其中B組與A組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），C組、D組與A組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），經(jīng)統(tǒng)計學相關性分析，細胞的表觀黏性與bFGF的濃度有明顯的相關性，其相關系數(shù)為：0.662。C組與D組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 5.2.3 LIM組在不同濃度bFGF作用下，無論是平衡楊氏模量還是細胞表觀黏性，其差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 5.2.4 LIM組的細胞力

12、學特性與SC組中各組比較，發(fā)現(xiàn)無論是平衡楊氏模量還是細胞表觀黏性，其與SC組中A組、B組比較均增高，其差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與C組、D組比較其差異無統(tǒng)計學意義（.P>0.05）。
　　 結論：
　　 1凹透鏡誘導可引起豚鼠實驗性近視眼明顯軸性近視。
　　 2 bFGF可以有效的刺激豚鼠鞏膜成纖維細胞的增長，在本實驗的幾種濃度中，1ng/ml組對細胞增長無明顯的刺激作用，10ng/ml、100ng/ml

13、的濃度對細胞增長有明顯的刺激作用，其中10ng/ml的作用最強，但對實驗眼和對照眼來說，其效果無明顯差異。
　　 3 TGF-β2在實驗眼的表達明顯高于對照眼，F(xiàn)GFR-1在實驗眼的表達明顯低于對照眼。
　　 4 bFGF可以有效的刺激FGFR-1的表達，且呈明顯的劑量-效應關系，但對TGF-β2的表達變無明顯作用。
　　 5 LIM組鞏膜成纖維細胞的平衡楊氏模量、表觀黏性較SC組均發(fā)生了明顯的升高，表明鞏膜成纖

14、維細胞力學特性在近視眼中的代償性升高。
　　 61ng/ml組bFGF未能改變SC組鞏膜成纖維細胞的平衡楊氏模量及表觀黏性，但10ng/ml組，100ng/ml組bFGF與空白組比較可以提高SC組鞏膜成纖維細胞的平衡楊氏模量及表觀黏性。
　　 7本實驗的幾種bFGF濃度未能改變LIM組鞏膜成纖維細胞的平衡楊氏模量及表觀黏性，說明對于同SC組相比力學特性已經(jīng)改變的LIM組鞏膜成纖維細胞來說，同樣程度的刺激不能引起同樣程度的