全長A型肉毒毒素突變體構建及其在產氣莢膜梭菌系統(tǒng)中表達的研究.pdf

1、肉毒神經毒素（botulinum neurotoxin, BoNT)是一種大分子的毒性蛋白，根據其抗原性的不同，可分劃為A～G 7種血清型。每型BoNT均由一條單一多肽鏈組成，分子量約為150KDa，在結構上分為兩部分：輕鏈（Lc，50kDa）為活性結構域，具有鋅依賴性金屬內肽酶活性；重鏈（Hc，100kDa）為結合和轉位結構域。由于BoNT的中毒劑量小，潛伏期短，致死率高，已成為最具威脅的生物恐怖劑之一。所以，發(fā)展BoNT疫苗對預防肉

2、毒中毒，以及應對生物恐怖襲擊具有重要的醫(yī)學意義。
　　 首先，為了評價BoNT/A Lc突變體蛋白的活性，我們克隆、表達了BoNT/A Lc的作用底物SNAP-25蛋白。將本室保存的pET22b-SNAP25質粒轉入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，25℃，120r/min水浴搖床振蕩培養(yǎng)過夜，采用終濃度為1mM的IPTG誘導表達，表達產物經過SDS-PAGE電泳分析。結果表明，目的蛋白在上清和包涵體中均有分布，為了

3、保證SNAP-25的生物學活性，我們采用了上清中的蛋白來進行下一步的活性分析實驗。
　　 其次，利用實驗室已構建的含有BoNT/A Lc目的基因片段的質粒pET-32a-Alc，采用定點突變技術，對BoNT/A Lc中Arg362、Tyr365和Glu350三個關鍵性的氨基酸位點進行了突變，獲得了BoNT/A Lc的突變體。采用低溫誘導，表達融合蛋白的方法，成功獲得了可溶性的BoNT/A Lc及其突變體蛋白。通過該突變體與BoN

4、T/A底物蛋白SNAP-25的切割反應，發(fā)現未經突變的BoNT/A Lc蛋白能夠特異性的識別SNAP-25上的Q197-R198位點，而突變體蛋白則完全無法識別該位點，不具有金屬內肽酶活性，從而證明通過定點突變，我們成功的去除了毒素的毒力，為下一步的全長BoNT/A重組疫苗的研究打下了基礎。
　　 最后，為有效表達全長BoNT/A大分子抗原，本實驗選用了與肉毒梭菌同屬的產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens

5、)表達系統(tǒng)。先以肉毒梭菌的DNA為模板，通過PCR的方法擴增全長3901bp的BoNT/A基因，并克隆至T載體得到pMD18T-BoNT/A載體，核苷酸序列測定結果表明，與GenBank上所公布的A型肉毒梭菌62A標準株（登錄號：M30196.1）序列一致性為100%。然后以pMD18T-BoNT/A載體為模板，按前述方法進行定點突變（Arg362Ala、Tyr365Phe、Glu350Ala）, 經測序分析正確后，經BstBI、Bsu