全長(zhǎng)A型肉毒毒素突變體構(gòu)建及其在產(chǎn)氣莢膜梭菌系統(tǒng)中表達(dá)的研究.pdf

1、肉毒神經(jīng)毒素（botulinum neurotoxin, BoNT)是一種大分子的毒性蛋白，根據(jù)其抗原性的不同，可分劃為A～G 7種血清型。每型BoNT均由一條單一多肽鏈組成，分子量約為150KDa，在結(jié)構(gòu)上分為兩部分：輕鏈（Lc，50kDa）為活性結(jié)構(gòu)域，具有鋅依賴性金屬內(nèi)肽酶活性；重鏈（Hc，100kDa）為結(jié)合和轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域。由于BoNT的中毒劑量小，潛伏期短，致死率高，已成為最具威脅的生物恐怖劑之一。所以，發(fā)展BoNT疫苗對(duì)預(yù)防肉

2、毒中毒，以及應(yīng)對(duì)生物恐怖襲擊具有重要的醫(yī)學(xué)意義。
　　 首先，為了評(píng)價(jià)BoNT/A Lc突變體蛋白的活性，我們克隆、表達(dá)了BoNT/A Lc的作用底物SNAP-25蛋白。將本室保存的pET22b-SNAP25質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，25℃，120r/min水浴搖床振蕩培養(yǎng)過夜，采用終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明，目的蛋白在上清和包涵體中均有分布，為了

3、保證SNAP-25的生物學(xué)活性，我們采用了上清中的蛋白來進(jìn)行下一步的活性分析實(shí)驗(yàn)。
　　 其次，利用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含有BoNT/A Lc目的基因片段的質(zhì)粒pET-32a-Alc，采用定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)BoNT/A Lc中Arg362、Tyr365和Glu350三個(gè)關(guān)鍵性的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了突變，獲得了BoNT/A Lc的突變體。采用低溫誘導(dǎo)，表達(dá)融合蛋白的方法，成功獲得了可溶性的BoNT/A Lc及其突變體蛋白。通過該突變體與BoN

4、T/A底物蛋白SNAP-25的切割反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)突變的BoNT/A Lc蛋白能夠特異性的識(shí)別SNAP-25上的Q197-R198位點(diǎn)，而突變體蛋白則完全無法識(shí)別該位點(diǎn)，不具有金屬內(nèi)肽酶活性，從而證明通過定點(diǎn)突變，我們成功的去除了毒素的毒力，為下一步的全長(zhǎng)BoNT/A重組疫苗的研究打下了基礎(chǔ)。
　　 最后，為有效表達(dá)全長(zhǎng)BoNT/A大分子抗原，本實(shí)驗(yàn)選用了與肉毒梭菌同屬的產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens

5、)表達(dá)系統(tǒng)。先以肉毒梭菌的DNA為模板，通過PCR的方法擴(kuò)增全長(zhǎng)3901bp的BoNT/A基因，并克隆至T載體得到pMD18T-BoNT/A載體，核苷酸序列測(cè)定結(jié)果表明，與GenBank上所公布的A型肉毒梭菌62A標(biāo)準(zhǔn)株（登錄號(hào)：M30196.1）序列一致性為100%。然后以pMD18T-BoNT/A載體為模板，按前述方法進(jìn)行定點(diǎn)突變（Arg362Ala、Tyr365Phe、Glu350Ala）, 經(jīng)測(cè)序分析正確后，經(jīng)BstBI、Bsu