反義miR-103上調(diào)TIMP-3影響子宮內(nèi)膜癌侵襲和增殖能力的體外研究.pdf

1、目的：子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)，嚴(yán)重影響女性生命健康，因此探討子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制有重要的意義。目前大量研究表明MiRNA在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等有密切的關(guān)系。MiRNA103在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)異常增高，本研究利用反義技術(shù)下調(diào)miR-103的表達(dá)后，結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)驗(yàn)證其在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中的靶基因TIMP-3，并探討其通過(guò)調(diào)控靶基因在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中發(fā)揮的生物學(xué)功能，為理解miR-1

2、03在子宮內(nèi)膜癌形成過(guò)程中的作用提供依據(jù)。
　　 方法：體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1B細(xì)胞株，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)Anti-miR-103轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，以無(wú)義隨機(jī)序列作為對(duì)照，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-103表達(dá)水平的變化；構(gòu)建熒光報(bào)告載體質(zhì)粒pGL3/TIMP-3-wt和pGL3/TIMP-3-mut，并將其與Anti-miR-103和海腎質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，檢測(cè)熒光素酶活性的變化；Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染A

3、nti-miR-103后Ishikawa和HEC-1B細(xì)胞株中TIMP-3蛋白質(zhì)表達(dá)的變化；MTT法檢測(cè)miR-103下調(diào)后對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；Annexin V-PE雙染后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況；Tranwell腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果：實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)轉(zhuǎn)染Anti-miR-103后，Ishikawa和HEC-1B細(xì)胞株中miR-103的表達(dá)水平明顯下調(diào)；Anti-miR103和pGL3-TI

4、MP-3-wt共轉(zhuǎn)染組相對(duì)熒光活性值明顯高于無(wú)義隨機(jī)序列和pGL3-TIMP-3-wt共轉(zhuǎn)染組；Westem blot技術(shù)證實(shí)轉(zhuǎn)染Anti-miR-103后可明顯上調(diào)TIMP-3蛋白質(zhì)表達(dá)；MTT法證實(shí)轉(zhuǎn)染Anti-miR-103后可明顯抑制細(xì)胞的增殖能力；細(xì)胞凋亡檢測(cè)提示轉(zhuǎn)染Anti-miR-103組與陰性對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡情況無(wú)明顯差別；Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)提示轉(zhuǎn)染Anti-miR-103后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株的侵襲能力明