間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合環(huán)孢霉素A對(duì)角膜移植排斥的作用研究.pdf

1、穿透性角膜移植術(shù)(penetratingkeratoplasty，PKP)的術(shù)后免疫排斥反應(yīng)是導(dǎo)致手術(shù)失敗的最主要原因。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞(包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞)增殖和功能的作用。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)MSCs可以延長(zhǎng)角膜植片存活時(shí)間，在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)大鼠異體角膜移植排斥反應(yīng)動(dòng)物模型，觀察不同時(shí)期尾靜脈注射MSCs，以及MSCs聯(lián)合不同

2、濃度環(huán)孢霉素A(CyclosporinA，CsA)對(duì)角膜抑制排斥反應(yīng)發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的干預(yù)情況，初步闡明MSCs的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理，以及MSCs與CsA之間的聯(lián)合作用，為臨床治療角膜移植排斥反應(yīng)提供新的思路和可供選擇的方法。
　　方法:
　　1.原代培養(yǎng)Wistar大鼠MSCs，達(dá)90％融合時(shí)傳代培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的表型，并做體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
　　2.制作大鼠角膜移植動(dòng)物模型，隨機(jī)分為12組。注：

3、其中(A、B、C組為重復(fù)上一階段實(shí)驗(yàn)組)A組：對(duì)照組，給予等量不含藥物的PBS。B組：術(shù)前尾靜脈注射MSCs組。C組：術(shù)后尾靜脈注射MSCs組。D組：排斥發(fā)生時(shí)尾靜脈注射MSCs組。E組：術(shù)后注射MSCs+肌注1mg/kg/天CsA。F組：術(shù)后注射等量PBs+肌注lmg/kg/天CsA。G組：術(shù)后注射MSCs+肌注2mg/kg/天CsA。H組：術(shù)后注射等量PBS+肌注2mg/kg/天CsA。I組：術(shù)后注射MSCs+肌注5mg/kg/天C

4、sA。J組：術(shù)后注射等量PBs+肌注5mg/kg/天CsA。K組：術(shù)后注射MSCs+肌注10mg/kg/天CsA。L組：術(shù)后注射等量PBs+肌注10mg/kg/天CsA。裂隙燈下對(duì)角膜植片進(jìn)行臨床觀察，以混濁、水腫和新生血管3項(xiàng)指標(biāo)作為臨床評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，比較各組角膜植片的平均存活時(shí)間。
　　3.角膜移植模型建立后10天，收集A、C、G與H組大鼠脾臟以及腹股溝淋巴結(jié)，分離單個(gè)核細(xì)胞，在刀豆蛋白A(concanavalinA，ConA)刺

5、激下孵育72h后，采用BrdU試劑盒檢測(cè)各組大鼠免疫應(yīng)答強(qiáng)度。
　　4.取ConA刺激下A、C、G與H組大鼠脾臟和淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞孵育72h后的上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)Th1類(lèi)和Th2類(lèi)細(xì)胞因子分泌情況。
　　5.角膜移植模型建立后10天，取A組和C組大鼠脾臟以及淋巴結(jié)，流式細(xì)胞儀測(cè)定CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離并鑒定了MSCs，MSCs呈間

6、質(zhì)細(xì)胞特性：梭形，漩渦狀排列。VonKossa染色、油紅染色貼壁細(xì)胞呈骨樣細(xì)胞及脂肪樣細(xì)胞分化。
　　2.成功建立大鼠角膜移植動(dòng)物模型。
　　3.采用MSCs單獨(dú)治療角膜移植術(shù)后大鼠，術(shù)后注射組角膜植片的存活時(shí)間與A組相比明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。術(shù)前和排斥時(shí)治療組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　4.單獨(dú)使用CsA治療角膜移植術(shù)后大鼠，除F組，H、J和L組大鼠角膜植片存活時(shí)間均顯著延長(zhǎng)(P<0.05

7、)。
　　5.MSCs與2mg/kg的CsA聯(lián)合治療大鼠排斥模型時(shí)(G組)，與單獨(dú)使用MSCs或2mg/kgCsA相比(C和H組)，植片存活時(shí)間延長(zhǎng)。MSCs與5mg/kgCsA或10mg/kgCsA聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，聯(lián)合效果不顯著(P>0.05)。而MSCs與1mg/kgCsA聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，MSCs對(duì)植片的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。
　　6.T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，MSCs和/或CsA均可以顯著抑制T細(xì)胞增殖(P<0.05)。<

8、br>　　7.ELISA結(jié)果顯示，C、G、H組Th1細(xì)胞因子分泌顯著降低(P<0.05)，而Th2細(xì)胞因子(IL-4)分泌升高(P<0.05)。與對(duì)照組(A組)相比，C組大鼠體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例顯著增高(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　MSCs可以通過(guò)抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答、改變Th1/Th2應(yīng)答平衡以及上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，有效預(yù)防并治療角膜移植免疫排斥反應(yīng)。MSCs與CsA聯(lián)合使用，其效果取決于C