SELEX技術(shù)篩選青霉素類抗生素適體及其運用方法的初步探索.pdf

1、青霉素類抗生素(Penicillin-antibiotic)是一類高效的抗革蘭氏陽性菌藥物。由于頻繁地以超劑量使用，造成其在動物源性食品中的殘留，嚴(yán)重影響人們身體健康和進(jìn)出口貿(mào)易。因此開發(fā)快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟的檢測青霉素類抗生素殘留的方法在生產(chǎn)和生活中具有重要意義。 目前對青霉素類抗生素殘留的檢測方法主要有微生物法、儀器分析法、免疫試劑盒法等，上述方法已經(jīng)廣泛地用于日常檢測的各個方面，在運用中各有其優(yōu)缺點：微生物法經(jīng)濟實用，但耗時長

2、，特異性和靈敏度差；儀器分析法特異性好、靈敏度高，但步驟煩瑣，且需要采用昂貴的設(shè)備；免疫試劑盒法具有檢測速度快、特異性好等特點，但其價格比較貴。 本研究主要通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)從龐大的核酸文庫(容量為3×1014)中篩選獲得與靶分子6-氨基青霉烷酸(6-APA)具有高特異性親和的寡核苷酸適體(aptamer)，并對其運用方法進(jìn)行初步探索，為核酸適體檢測青霉素類抗生素殘留奠定基礎(chǔ)。全文分為兩個部分：

3、 一、運用含35個隨機序列，全長為78nt的ssDNA作為篩選文庫，采用Epoxy活化瓊脂糖凝膠FF作為固相分離介質(zhì)偶聯(lián)6-APA。通過SELEX技術(shù)用核酸文庫與配體相親和，經(jīng)緩沖液洗脫，將吸附在配體上的核酸用PCR進(jìn)行擴增，保留擴增產(chǎn)物，作為下一輪親和的文庫，如此反復(fù)。其中，每3輪進(jìn)行一次反篩，選用甘氨酸Gly偶聯(lián)在Epoxy活化瓊脂糖凝膠FF作為反篩物，以除去和瓊脂糖凝膠特異性親和的ssDNA。在篩選過程中，逐步提高洗脫液的洗脫強度

4、，經(jīng)過25輪SELEX循環(huán)篩選獲得能與6-APA特異性親和的寡核苷酸適體。將最后一輪的PCR產(chǎn)物和T載體相連接，通過轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆，隨機挑選12個白色菌落，經(jīng)菌落直接PCR得到10個陽性克隆。測序后成功得到9個DNA序列，對其一、二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，通過DNASYS V2.5軟件分析二級結(jié)構(gòu)的差異，根據(jù)序列的差異將適體初步分成A、B、C、D、E五組。 二、以篩選出的核酸適體序列為基礎(chǔ)，結(jié)合PCR技術(shù)，將β-內(nèi)酰胺類抗生

5、素——氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AMO)和頭孢曲松(Ceftriaxone)——偶聯(lián)到Epoxy活化瓊脂糖凝膠FF上進(jìn)行檢測，初步確定青霉素類抗生素的最佳適體為D組ssDNA；然后，將一定濃度的6-APA偶聯(lián)到Epoxy活化瓊脂糖凝膠FF上，用甘氨酸封閉，通過D組適體進(jìn)行親和，接合PCR技術(shù)，初步測定該方法的檢測范圍可達(dá)到2.5μg/kg：最后，通過核酸適體結(jié)合PCR檢測法對雞肉組織中的青霉素類抗生素殘留進(jìn)行檢測，并用傳統(tǒng)的微生物法