泛素活化酶E1抑制與富含氫氣生理鹽水對血管損傷后內(nèi)膜增生的作用及機制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 當前，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的治療已經(jīng)進入藥物支架時代。藥物支架是針對既往單純球囊擴張以及裸金屬支架植入后再狹窄而研發(fā)的，而再狹窄產(chǎn)生的病理生理基礎(chǔ)是血管損傷后平滑肌細胞的異常增殖、遷移，進而導(dǎo)致的血管內(nèi)膜增殖和管腔狹窄。目前，臨床常用的藥物支架能夠顯著抑制血管平滑肌細胞的增殖和血管內(nèi)膜的增生，大大降低了血管再狹窄的比例；但是目前支架藥物特異性不夠高，引發(fā)內(nèi)皮延遲愈合及支架內(nèi)血栓等嚴重并發(fā)癥。而且血管損

2、傷后內(nèi)膜增生這一仍舊困擾動脈粥樣硬化治療難題的機制也未完全闡明。因此，深入探討血管損傷后內(nèi)膜增生機制，尋找新的潛在藥物靶點及研發(fā)新型治療藥物，對進一步提升抗動脈粥樣硬化治療效果和降低血管再狹窄發(fā)生率有重要意義。
　　 一、泛素活化酶E1：血管損傷后新的潛在治療靶點
　　 泛素蛋白酶體系統(tǒng)主司機體蛋白質(zhì)的降解，并參與多種病理生理過程。蛋白質(zhì)的降解，分為蛋白質(zhì)泛素化和蛋白酶體降解兩個步驟。泛素是由76個氨基酸組成，是蛋白質(zhì)被

3、降解的“標簽”。蛋白質(zhì)泛素化是一個由E1-E2-E3級聯(lián)酶促催化的過程，并最終將泛素共價連接到蛋白質(zhì)。生物體內(nèi)僅存1-2分子泛素活化酶E1，而有20-30個E2，數(shù)百個E3分子；泛素化修飾的蛋白質(zhì)進而被蛋白酶體降解。
　　 既往研究報道，泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與血管動脈粥樣硬化及血管損傷修復(fù)過程。最早有研究認為在動脈粥樣硬化及血管新生內(nèi)膜中均出現(xiàn)泛素蛋白酶體系統(tǒng)功能異常；近年亦發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑可減少血管損傷后內(nèi)膜增生。體外研究也

4、表明蛋白酶體抑制劑可減緩平滑肌細胞的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化。上述研究揭示了蛋白酶體參與血管損傷內(nèi)膜增生的作用及機制，但對于泛素化過程的作用尚不清楚。
　　 在泛素酶促反應(yīng)體系中，泛素活化酶E1是該系統(tǒng)的起始分子，是生物體內(nèi)是啟動蛋白降解的開關(guān)，同時在大多數(shù)生物體內(nèi)僅存1-2個蛋白，且以UBE1/UBA1功能為主。鑒于蛋白酶體在血管損傷修復(fù)中的重要作用，我們推測泛素活化酶E1可能在血管損傷后內(nèi)膜增生起重要作用。
　　 因此，

5、在本課題第一到第四部分，我們從動物模型和細胞水平驗證泛素活化酶E1在血管損傷后內(nèi)膜增生的作用及其藥物靶點的價值。以期為進一步闡明泛素活化酶E1在血管損傷中的作用提供實驗依據(jù)，并為抑制血管損傷后內(nèi)膜增生和治療再狹窄提供新的思路。
　　 二、H2：抑制血管損傷后內(nèi)膜增生的新型抗氧化劑
　　 眾所周知，氧化應(yīng)激在血管損傷后內(nèi)膜增生中起重要作用。血管損傷誘發(fā)血管局部氧化應(yīng)激，加劇炎癥浸潤，加重血管內(nèi)膜增生。既往針對血管損傷后的氧

6、化應(yīng)激的動物實驗研究取得諸多進展；然而，臨床研究提示抗氧化治療并未給病人帶來顯著收益。這就提示仍需深入研究機體血管損傷后的氧化應(yīng)激并尋找新型的抗氧化劑。自2007年以來，H2在生物體被認為是新型抗氧化劑，并在多種病理生理過程中被證明具有良好的抗氧化效應(yīng)。
　　 因此，在本課題第五部分，我們探討了H2對血管損傷后內(nèi)膜增生的影響及其機制，為H2潛在的抗血管內(nèi)膜增生的藥物價值提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.

7、血管損傷內(nèi)膜增生局部泛素蛋白酶體系統(tǒng)的改變以及局部給予化學(xué)抑制劑后內(nèi)膜增生的情況
　　 1.1.制備大鼠血管球囊損傷模型，提取蛋白質(zhì)，采用Western Blot方法檢測血管損傷后7d、14d泛素活化酶E1以及泛素化蛋白質(zhì)的表達水平；同時采用免疫染色，檢測血管損傷后泛素化蛋白質(zhì)表達的定位。
　　 1.2.泛素活化酶E1化學(xué)抑制劑PYR-41(100μM)以及對照組DMSO溶液經(jīng)由頸外動脈注入50μL，室溫持續(xù)30min。

8、術(shù)后7d、14d，HE染色檢測血管損傷后內(nèi)膜增生情況，計算其內(nèi)膜面積、中膜面積和兩者比值。
　　 2.血管損傷局部E1基因敲減對血管損傷后內(nèi)膜增生的影響
　　 2.1.構(gòu)建泛素活化酶E1基因干擾慢病毒：設(shè)計四對基因干擾序列，構(gòu)建干擾質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染VSMCs，采用Realtime RCR方法檢測其具體的干擾效率，優(yōu)選出兩對效率較高的序列；將優(yōu)選序列構(gòu)建入慢病毒表達載體，進而和包裝質(zhì)粒和胞膜質(zhì)粒一起包裝、制備慢病毒。

9、　　 2.2.泛素活化酶E1干擾慢病毒轉(zhuǎn)染損傷血管：將包裝的慢病毒首先轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的VSMCs，檢測其轉(zhuǎn)染效率和敲減泛素活化酶E1的效率；將轉(zhuǎn)染效率最高的慢病毒在血管損傷局部轉(zhuǎn)染，在3d、7d、14d通過對GFP的Western Blot和免疫組化檢測其轉(zhuǎn)染效率；并在血管損傷后7d、14d行HE染色，檢測其血管內(nèi)膜增生情況。
　　 3.損傷血管局部泛素活化酶E1抑制后對凋亡及炎癥的影響。
　　 通過TUNEL方法檢測在

10、血管局部給予化學(xué)抑制劑PYR-413h、8h后，損傷血管局部的凋亡細胞數(shù)量；并在給予PRY-41和干擾慢病毒組進行免疫熒光化學(xué)、WesternBlot檢測7d、14d時損傷血管的NFκB、CD68的表達、定位情況；EMSA檢測損傷血管NFκB的DNA結(jié)合活性。
　　 4.泛素活化酶E1抑制后對體外培養(yǎng)VSMCs功能的影響及機制
　　 4.1.通過組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)VSMCs，并采用SMα actin免疫熒光化學(xué)進行鑒定；在

11、不同濃度的PYR-41以及干擾慢病毒處理VSMCs后，分別采用細胞計數(shù)、3H-TdR摻入檢測對VSMCs的增殖的影響；流式細胞儀檢測PYR-41處理及干擾慢病轉(zhuǎn)染VSMCs后各個細胞時期的比例；流式細胞儀Annexin V/PI染色檢測VSMCs凋亡的情況。
　　 4.2.VSMCs在PYR-41處理以及干擾慢病毒處理后，提起其蛋白質(zhì)檢測短半衰期蛋白質(zhì)p21、p53、c-jun的含量，以及IκBα、IκBβ的含量；EMSA檢測在

12、PYR-41處理以及干擾慢病毒處理后，NFκB的活化。
　　 5.檢測富含氫氣生理鹽水對血管損傷后內(nèi)膜增生的影響并探討機制
　　 5.1.檢測富含氫氣生理鹽水的pH值以及體內(nèi)注射后，其在血相含量的變化
　　 5.2.采用富含氫氣生理鹽水注射球囊損傷后大鼠，10mL/kg，分別在14d以及21d，采用HE染色計算其血管損傷后內(nèi)膜面積
　　 5.3.富含氫氣生理鹽水治療球囊損傷大鼠后，檢測損傷血管局部ROS含

13、量：并測量血管及血清SOD、GSH、MDA的含量；分別采用PCR、ELISA檢測IL-6的mRNA和蛋白質(zhì)水平的變化；采用Western Blot檢測血管損傷局部NFκB和TNFα的變化
　　 5.4.采用細胞計數(shù)和CCK-8檢測富含氫氣培養(yǎng)基對體外培養(yǎng)VSMCs的增殖的變化影響；采用改良的Boyden小室檢測富含氫氣培養(yǎng)基對VSMCs遷移的影響
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.大鼠頸動脈球囊損傷后，泛素化蛋白質(zhì)的表

14、達在7d和14d時，明顯增高(p<0.05)。而同時泛素化酶E1的表達水平并未隨著時間而增高(p>0.05)。增強的泛素化蛋白質(zhì)的表達定位在血管新生內(nèi)膜。局部給予泛素活化酶E1化學(xué)抑制劑可在第7d、14d顯著減少血管內(nèi)膜面積(p<0.05)；且新生內(nèi)膜的PCNA陽性細胞數(shù)也顯著減少(p<0.05)。
　　 2.測序報告提示，成功構(gòu)建泛素活化酶E1的干擾質(zhì)粒；初步篩選出干擾效率較高的兩條序列CTCTTGTTGAAGACTTCCTT

15、A，CCTGGGATGTCACGAAGTTAA。構(gòu)建入慢病毒載體，包裝、制備成慢病毒，其滴度分別為1.02×109/mL和8.22×108/mL。轉(zhuǎn)染VSMCs后，轉(zhuǎn)染效率為90.3±0.9%，可有效降低泛素活化酶E1的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平。損傷局部給藥后，免疫組化在轉(zhuǎn)染后3d觀察到GFP的表達，Western Blot檢測到7d、14d GFP的表達，表明慢病毒可有效轉(zhuǎn)染血管局部。在轉(zhuǎn)染后7d、14d，HE染色可見內(nèi)膜增生顯著減少

16、(p<0.01)，分別下降42.4%和32.5%。PCNA陽性細胞比例由對照組的40.12±3.81%顯著下降到病毒干擾組的22.17±1.53%。
　　 3.和對照組比較，PYR-41局部損傷血管給藥在3h、8h可顯著增加誘導(dǎo)血管壁細胞凋亡數(shù)量。PYR-41和干擾慢病毒均可減少NFκB p65的表達和核轉(zhuǎn)位減少，減弱其DNA結(jié)合活性。免疫組化和Western Blot也表明，損傷血管局部PYR-41處理和慢病毒干擾后，CD68

17、陽性的單核巨噬細胞的浸潤減少。
　　 4.在體外培養(yǎng)的原代VSMCs上，PYR-41可顯著抑制VSMCs的增殖，且呈濃度依賴型。干擾慢病毒敲減E1后，也顯著抑制了VSMCs的增殖。PYR-41和干擾慢病毒均可減少VSMCs的S期細胞比例。PYR-41在誘導(dǎo)VSMCs的凋亡，且呈濃度依賴性。PYR-41和干擾慢病毒均可阻斷短半衰期蛋白質(zhì)的降解，顯著增加了p21、p53、c-jun等分子的蛋白質(zhì)水平(p<0.01)。Western

18、Blot發(fā)現(xiàn)泛素活化酶E1抑制降低了VSMCs NFκB p65蛋白質(zhì)水平；EMSA也表明泛素活化酶E1抑制后，NFκB的活性下降，并且其對NFκB的活性抑制是通過減少IκBα和IκBβ降解介導(dǎo)的。
　　 5.富含氫氣生理鹽水注射機體后，可在30min內(nèi)顯著增加血漿內(nèi)H2濃度：注射富含氫氣生理鹽水可顯著減少血管內(nèi)膜增生，PCNA陽性細胞比例也由21.03±2.56%顯著下降到富含氫氣生理鹽水治療組的9.17±4.86%(p<0.

19、05)。富含氫氣生理鹽水可降低損傷血管局部ROS水平，減少組織局部和血清的MDA水平(p<0.05)，增加血管損傷局部和血清的SOD、GSH水平(p<0.05)。富含氫氣生理鹽水還減少了血管局部IL-6、TNFα、NFκB p65的表達水平和CD68陽性單核巨噬細胞的浸潤(p<0.05)。在離體VSMCs上，富含氫氣生理鹽水還減少了高糖誘導(dǎo)的8-OdH以及PDGF-BB誘導(dǎo)的ROS增加；并同時減弱了PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs的增殖和

20、遷移能力(p<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.血管損傷后新生內(nèi)膜局部泛素化蛋白質(zhì)表達增高。
　　 2.局部化學(xué)抑制或基因敲減泛素活化酶E1可有效抑制血管損傷后內(nèi)膜增生。
　　 3.局部化學(xué)抑制或者基因敲減泛素活化酶E1后可減弱血管局部炎癥反應(yīng)。
　　 4.化學(xué)抑制劑PYR-41可誘導(dǎo)VSMCs的凋亡；而化學(xué)抑制或者基因敲減均可抑制VSMCs的增殖及細胞周期進展。
　　 5.化學(xué)抑制或