轉(zhuǎn)前強(qiáng)啡肽基因修飾人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株的建立及鎮(zhèn)痛效應(yīng)研究.pdf

1、目的和背景：
　　各種原因引起的慢性疼痛是臨床工作中的棘手問(wèn)題之一，它不僅影響患者的生活質(zhì)量，也逐漸成為了一項(xiàng)社會(huì)負(fù)擔(dān)，但關(guān)于這方面的治療進(jìn)展甚為緩慢，目前已有的藥物療效尚不盡人意，這迫切需要我們醫(yī)學(xué)工作者尋求更安全有效的治療方法。
　　經(jīng)多年的研究證實(shí)，生物鎮(zhèn)痛具有廣闊的發(fā)展前景，但目前目的基因、移植細(xì)胞和載體的研究尚在進(jìn)行中。前期研究已證實(shí)內(nèi)分泌肽家族之一的腦啡肽具有鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用，但要達(dá)到理想的鎮(zhèn)痛效果需要較大的

2、劑量。后續(xù)有研究表明κ受體激動(dòng)劑強(qiáng)啡肽（dynorphin，Dyn）作為一種內(nèi)源性鎮(zhèn)痛介質(zhì)，廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其生物鎮(zhèn)痛活性比腦啡肽強(qiáng)700倍，Long等[1]發(fā)現(xiàn)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔注射Dyn的鎮(zhèn)痛劑量?jī)H為2.5～5.0 nmol就可以達(dá)到滿意的鎮(zhèn)痛效果，更適用于生物鎮(zhèn)痛研究。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）因?yàn)榫哂械兔庖咴?、多向分化潛能及定向歸巢等生物學(xué)特性

3、，成為理想的移植細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)研究擬以重組腺病毒載體為基礎(chǔ)，將前強(qiáng)啡肽基因（prodynorphoin,PDP）導(dǎo)入到人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs），獲得能表達(dá)強(qiáng)啡肽基因及分泌強(qiáng)啡肽蛋白的干細(xì)胞株（hBMSCs-PDP），并移植入坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷（chronic constriction injury，CCI）模型的大鼠髓鞘內(nèi)，利用BMSCs的定向歸巢和定向分化的特性，實(shí)現(xiàn)靶向性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞鎮(zhèn)痛，評(píng)價(jià)其鎮(zhèn)痛效應(yīng)，為生物鎮(zhèn)痛技術(shù)的發(fā)

4、展和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　1.材料和方法：
　　1.1重組腺病毒Ad5F35-PDP
　　前期實(shí)驗(yàn)肖建斌等[2]人已成功構(gòu)建用Ad5F35載體制備攜帶前強(qiáng)啡肽原基因的重組腺病毒Ad5F35-PDP并饋贈(zèng)于本實(shí)驗(yàn)研究。該實(shí)驗(yàn)運(yùn)用第5代腺病毒Ad5F35，通過(guò)與AdMaxTM系統(tǒng)進(jìn)行同源重組，制備了含前強(qiáng)啡肽（prodynorphin，PDP）基因全序列的Ad5F35-PDP重組腺病毒，并對(duì)其進(jìn)行了滴度測(cè)定，為本實(shí)驗(yàn)對(duì)該

5、重組腺病毒的生物學(xué)功能研究及今后的轉(zhuǎn)基因治療奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　1.2重組腺病毒Ad5F35-PDP轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hBMSCs
　　本實(shí)驗(yàn)以重組腺病毒Ad5F35-PDP為載體，將前強(qiáng)啡肽基因（PDP)導(dǎo)入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs），獲得具有分泌強(qiáng)啡肽特性的細(xì)胞株，同時(shí)探討轉(zhuǎn)基因建立的細(xì)胞株hBMSCs-PDP的的增殖情況、細(xì)胞活力、傳代過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)是否發(fā)生改變，以及目的基因強(qiáng)啡肽的表達(dá)情況。最后通過(guò)

6、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株hBMSCs-PDP移植入神經(jīng)病理性疼痛大鼠髓鞘內(nèi)，利用hBMSCs在體內(nèi)定向歸巢和定向分化的特點(diǎn)，驗(yàn)證hBMSCs-PDP靶向性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鎮(zhèn)痛效果。
　　1.3神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠髓鞘內(nèi)注射hBMSCs-PDP的鎮(zhèn)痛效果
　　取健康雄性SD大鼠40只（實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各種原因淘汰的大鼠均由后續(xù)實(shí)驗(yàn)補(bǔ)齊），體重150～180 g，周齡6～8周，隨機(jī)分為4組（n=10），A組為正常對(duì)照組；B組、C組和D組

7、均行髓鞘內(nèi)置管，導(dǎo)管固定于大鼠背部皮下，且均在大鼠右腿（術(shù)側(cè)）通過(guò)坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷法（CCI）建立神經(jīng)病理性疼痛模型，于CCI術(shù)后3 d分組給藥。B組髓鞘內(nèi)注射無(wú)菌生理鹽水20μl；C組鞘內(nèi)注射轉(zhuǎn)染空載體48h的hMSCs細(xì)胞懸液(hMSCs-空載體)20μl（1×106-2×106/μl）；D組鞘內(nèi)注射轉(zhuǎn)染目的基因前強(qiáng)啡肽原48h的hMSCs細(xì)胞懸液（hMSCs-PDP）20μl（1×106-2×106/μl）。于手術(shù)前1d、手

8、術(shù)后第3、5、7、9、11、13d分別測(cè)定SD大鼠右腿（術(shù)側(cè)）熱痛閾值。分別于術(shù)后第7d和第13d測(cè)完SD大鼠術(shù)側(cè)熱痛閾值后，取SD大鼠的新鮮脊髓組織，行免疫組化檢測(cè)脊髓后角強(qiáng)啡肽的表達(dá)情況，采用RT-PCR法測(cè)定PDP mRNA的表達(dá)，western blot法測(cè)定PDP蛋白的分泌，最后用裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)hMSCs-PDP細(xì)胞系的安全性。
　　2統(tǒng)計(jì)分析
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（

9、 SDX±）表示。組間及組內(nèi)均數(shù)的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析；兩兩比較采用LSD分析，以 P<0.05為差異有意義。
　　3結(jié)果：
　　1）重組腺病毒 Ad5F35-PDP成功轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs），并建立hBMSCs-PDP細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2） SD大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷法（CCI）神經(jīng)病理性疼痛模型提示：與A組比較， B組、C組、D組熱痛閾值降低(P<0.05)。與B組、C組比較，D

10、組熱痛閾值升高（P<0.05）。RT-PCR結(jié)果提示D組脊髓組織強(qiáng)啡肽mRNA表達(dá)比A組、B組、C組升高。免疫組化結(jié)果顯示：D組強(qiáng)啡肽表達(dá)較B組和C組增強(qiáng)。最后將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株注入裸鼠體內(nèi)，觀察一個(gè)月后未發(fā)現(xiàn)致畸致瘤性，表明注入的hBMSCs-PDP細(xì)胞系是安全的。
　　4結(jié)論：
　　1）重組腺病毒Ad5F35-PDP可成功轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2）大鼠髓鞘內(nèi)注射hBMSCs-PDP可減輕CCI模型SD大鼠的神經(jīng)