宮頸癌TSLP來(lái)源及其在營(yíng)造癌灶微環(huán)境中的作用.pdf

1、宮頸癌，是一種婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅婦女健康。但是至今為止，宮頸癌發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。近年，腫瘤微環(huán)境的研究引起廣泛高度重視，成為腫瘤生物學(xué)研究熱點(diǎn)。腫瘤局部微環(huán)境中的血管生成和免疫細(xì)胞對(duì)宮頸癌進(jìn)展發(fā)揮著不可或缺的調(diào)節(jié)作用。
　　TSLP是一種造血細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過(guò)程，如調(diào)節(jié)先天和獲得性免疫反應(yīng)，此外在過(guò)敏性皮膚病、呼吸道疾病、寄生蟲感染和調(diào)節(jié)腸道免疫中具有重要作用。我們課題組前期工作發(fā)現(xiàn)人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的

2、TSLP可以以劑量依賴的方式促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲力，并誘導(dǎo)母-胎界面Th2免疫優(yōu)勢(shì)。母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞具有獨(dú)特的類似于腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，即高增殖和侵襲能力。因此我們推測(cè)宮頸癌細(xì)胞可能通過(guò)分泌TSLP，以自分泌和旁分泌作用參與營(yíng)造宮頸癌微環(huán)境。闡明TSLP在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用將有助于闡明宮頸癌發(fā)病機(jī)制。
　　本研究在前期工作基礎(chǔ)上，探討宮頸癌細(xì)胞是否通過(guò)分泌TSLP調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng);進(jìn)一步闡明宮頸癌細(xì)胞分泌的TSLP對(duì)癌

3、灶新生血管形成的調(diào)節(jié)作用，及其對(duì)癌灶浸潤(rùn)的嗜酸性粒細(xì)胞功能的作用機(jī)制。
　　第一部分 TSLP對(duì)宮頸癌細(xì)胞活力的自分泌調(diào)節(jié)作用
　　目的：分析TSLP在宮頸癌中的表達(dá)及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：收集人宮頸炎和宮頸癌組織，免疫組化分析各組TSLP的表達(dá);ELISA檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞株（HeLa和CaSki細(xì)胞）不同時(shí)間點(diǎn)分泌的TSLP濃度;流式細(xì)胞術(shù)分析HeLa和CaSki細(xì)胞表面TSLP受體的表達(dá)水平;MT

4、T法分析不同濃度重組人TSLP對(duì)HeLa和CaSki細(xì)胞活力的調(diào)節(jié)作用;流式細(xì)胞術(shù)研究TSLP對(duì)HeLa和CaSki細(xì)胞增殖相關(guān)分子Ki-67表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：與宮頸炎相比，宮頸癌組織高表達(dá)TSLP;宮頸癌細(xì)胞株Caski和Hela細(xì)胞均分泌TSLP，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。此外，兩種細(xì)胞均表達(dá)TSLPR，Caski細(xì)胞表達(dá)TSLPR水平高于Hela細(xì)胞;TSLP處理CaSki和HeLa細(xì)胞48或72h后，能顯著增強(qiáng)其細(xì)胞活力

5、;重組人TSLP(rhTSLP)均能促進(jìn)CaSki和HeLa細(xì)胞表達(dá)Ki-67;抗人TSLP或TSLPR的中和性抗體下調(diào)Ki-67的表達(dá)。宮頸癌細(xì)胞通過(guò)分泌TSLP，以自分泌方式促進(jìn)Ki-67表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)自身增殖，有利于腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展。
　　結(jié)論：宮頸癌細(xì)胞可表達(dá)TSLP，以自分泌方式上調(diào)Ki-67表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)自身增殖，有利于腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展。
　　第二部分宮頸癌細(xì)胞來(lái)源的TSLP在新生血管形成中的調(diào)節(jié)作用
　　

6、目的：解析TSLP對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：收集人宮頸炎和宮頸癌組織，經(jīng)胰酶消化后獲得組織細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)分析各組血管內(nèi)皮細(xì)胞及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVECs)表面TSLPR的表達(dá)水平;然后分別用不同濃度人rhTSLP處理HUVECs，或者加入HeLa或CaSki細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)加入抗人TSLP或TSLPR中和性抗體，然后應(yīng)用BrdU增殖實(shí)驗(yàn)、Annexin V-FITC/PI雙染法和成管實(shí)驗(yàn)分別檢

7、測(cè)各組HUVECs的增殖、凋亡和成管能力;ELISA法檢測(cè)各組HUVECs分泌的IL-6、IL-8和VEGF水平;流式細(xì)胞術(shù)分析HUVECs細(xì)胞活化相關(guān)分子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：宮頸癌組織中，TSLP(+)的血管內(nèi)皮細(xì)胞比例為20.12％，明顯高于宮頸炎組織中的比例5.37％;重組人TSLP處理72h后，可刺激HUVECs增殖。阻斷TSLP或TSLPR可顯著抑制HeLa和CaSki細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖的促進(jìn)效應(yīng);r

8、hTSLP上調(diào)HUVECs表達(dá)Ki-67，阻斷TSLP或TSLPR可顯著降低與HeLa或CaSki細(xì)胞共培養(yǎng)的HUVECs表達(dá)Ki-67; TSLP對(duì)HUVECs表面凋亡相關(guān)分子（Fas和FasL）的表達(dá)無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用;rhTSLP顯著增加CD105的表達(dá)，但不改變CD62E的表達(dá);然而阻斷TSLP和TSLPR均可降調(diào)與HeLa或CaSki細(xì)胞共培養(yǎng)后的HUVECs細(xì)胞CD105和CD62E的表達(dá)水平;rhTSLP增加HUVECs生成I

9、L-6，而阻斷TSLP或TSLPR可減少HeLa細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和VEGF，并下調(diào)CaSki細(xì)胞分泌IL-6的水平。rhTSLP促進(jìn)HUVECs細(xì)胞血管生成;抗人TSLP中和性抗體抑制HeLa和CaSki細(xì)胞誘導(dǎo)的促進(jìn)HUVECs血管生成作用。
　　結(jié)論：宮頸癌細(xì)胞分泌的TSLP，以旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，一方面通過(guò)上調(diào)Ki-67表達(dá)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但不影響其凋亡;另一方面，通過(guò)上調(diào)CD105和CD62E的表

10、達(dá)，活化血管內(nèi)皮細(xì)胞;此外，通過(guò)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6等促血管生成因子，進(jìn)一步促進(jìn)新生血管形成。
　　第三部分宮頸癌細(xì)胞分泌的TSLP對(duì)癌灶內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞功能的調(diào)控作用
　　目的：探討TSLP對(duì)癌灶嗜酸性粒細(xì)胞的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)作用。
　　方法：收集人宮頸炎、LSIL、HSIL和宮頸癌組織，HE染色分析各組嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。此外臨床收集各組外周血嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量和比例;流式細(xì)胞術(shù)分析外周血嗜酸性粒

11、細(xì)胞表面TSLPR的表達(dá)水平;趨化試驗(yàn)分析rhTSLP對(duì)外周血嗜酸性粒細(xì)胞的趨化作用;隨后用rhTSLP處理定向誘導(dǎo)分化嗜酸性粒細(xì)胞(HL-60E)，或者建立與宮頸癌細(xì)胞株（HeLa和CaSki細(xì)胞）的間接共培養(yǎng)體系，ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)體系中IL-8、FGF、VEGF和GM-CSF的分泌水平;流式細(xì)胞術(shù)分析與HL-60E增殖、凋亡和功能相關(guān)分子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：隨著宮頸病變的逐漸進(jìn)展，病灶部位的嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)增加，二

12、者呈現(xiàn)明顯的正相關(guān);但是各組之間外周血嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量和比例無(wú)明顯差異。外周血嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)TSLP受體;rhTSLP可以以劑量依賴的方式募集外周血嗜酸性粒細(xì)胞;CaSki和HeLa細(xì)胞均能明顯上調(diào)HL-60細(xì)胞Ki-67、Bcl-2、FasL和Fas的表達(dá);且宮頸癌細(xì)胞來(lái)源的TSLP可以降調(diào)節(jié)HL-60細(xì)胞Fas的表達(dá)，但不參與對(duì)HL-60細(xì)胞Ki-67、Bcl-2和FasL表達(dá)調(diào)節(jié);CaSki或HeLa細(xì)胞明顯促進(jìn)HL-60細(xì)胞

13、HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá);但是宮頸癌細(xì)胞分泌的TSLP對(duì)于HL-60細(xì)胞HLA-DR和CD80的表達(dá)無(wú)調(diào)節(jié)作用，僅下調(diào)HL-60細(xì)胞表面CD86表達(dá);經(jīng)CaSki或HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)處理后，HL-60細(xì)胞表達(dá)各種細(xì)胞因子的水平均明顯增加，且對(duì)于IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-5的調(diào)節(jié)作用可以被rhTSLP、抗TSLP或TSLPR的中和性抗體部分逆轉(zhuǎn);與宮頸癌細(xì)胞CaSki或HeLa細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)后FGF的分泌水平

14、無(wú)改變;雖然HL-60E細(xì)胞本身不分泌IL-8，但是可以明顯促進(jìn)CaSki或HeLa細(xì)胞分泌IL-8，且升調(diào)節(jié)共培養(yǎng)體系中VEGF的分泌，且這一效應(yīng)可被共培養(yǎng)體系中引入的抗人TSLP或TSLPR的中和性抗體部分抑制。
　　結(jié)論：宮頸癌灶嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤進(jìn)展呈明顯正相關(guān);宮頸癌細(xì)胞通過(guò)分泌TSLP促進(jìn)臨近組織嗜酸性粒細(xì)胞向癌灶趨化的同時(shí)，通過(guò)刺激IL-5分泌進(jìn)一步促進(jìn)癌灶嗜酸性粒細(xì)胞祖細(xì)胞的分化成熟，并通過(guò)下調(diào)嗜酸性粒細(xì)胞Fa

15、s表達(dá)，抑制其凋亡，共同導(dǎo)致癌灶嗜酸性粒細(xì)胞的大量浸潤(rùn)。TSLP還可以下調(diào)嗜酸性粒細(xì)胞CD80表達(dá)、IFN-γ和TNF-α的分泌，上調(diào)IL-10和IL-5的分泌，誘導(dǎo)癌灶局部呈現(xiàn)獨(dú)特的細(xì)胞因子格局，有利于免疫耐受微環(huán)境形成。此外，宮頸癌細(xì)胞通過(guò)分泌TSLP能進(jìn)一步加強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞分泌促血管生成因子，有利于宮頸癌進(jìn)展。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TSLP對(duì)宮頸癌進(jìn)展具有多重調(diào)節(jié)作用:(1)通過(guò)自分泌作用直接上調(diào)Ki-67表

16、達(dá)，來(lái)促進(jìn)自身增殖生長(zhǎng);(2)通過(guò)旁分泌作用血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、活化和新生血管形成;(3)通過(guò)旁分泌作用招募臨近組織嗜酸性粒細(xì)胞到達(dá)癌灶局部和嗜酸性粒細(xì)胞祖細(xì)胞分化成熟，進(jìn)一步抑制嗜酸性粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞細(xì)胞分泌IL-10和IL-5，抑制其分泌IFN-γ和TNF-α，此外，通過(guò)加強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞之間的相互作用，進(jìn)而促進(jìn)微環(huán)境中促血管生成因子IL-8和VEGF的分泌，有利于癌灶周圍血管生成。本研究為完善