CD4+T細胞平衡失調與宮頸癌發(fā)生發(fā)展關系的研究.pdf

1、宮頸癌是嚴重威脅女性健康的疾病之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，位于女性惡性腫瘤的第二。近年來隨著人們思維方式和生活理念的變化，宮頸癌的發(fā)病率有明顯上升趨勢，發(fā)病年齡呈現年輕化。目前宮頸癌的病因尚未完全明了，與宮頸癌發(fā)病相關的因素很多，初次性交年齡過小、男或女方多個性伴侶、免疫力低下及宮頸慢性炎癥等良性疾病被認為是宮頸癌的重要危險因素。其他如吸煙、口服避孕藥、多孕多產、教育程度低、經濟狀況差和營養(yǎng)不良等也被認為是導致宮頸癌發(fā)生的關聯因素。已有研

2、究報道，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體炎癥感染密切相關，流行病學調查結果顯示，90％以上的宮頸癌患者伴有人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)感染，在HPV病毒持續(xù)存在的情況下，多種因素的共同作用破壞了宮頸上皮細胞，并誘導機體免疫應答平衡失調?？梢哉J為，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染被認為是重要的危險因素之一，目前幾乎所有的流行病學調查均顯示高危型HPV感染，是宮頸癌及癌前病變發(fā)病的主要條件。宮頸癌患者機體內免疫微環(huán)境的

3、變化也越來越受到重視。由于HPV感染所致宮頸病變直至發(fā)展為宮頸癌的自然史較長，在漫長的病程中，患者體內免疫功能狀態(tài)如何?自身的免疫系統(tǒng)如何清除病毒感染等都有待研究。近些年關于腫瘤免疫的研究表明，腫瘤患者有著免疫調節(jié)異常所產生的免疫抑制狀態(tài)，因此，深入研究宮頸癌患者的免疫抑制機制，探討基于免疫調控的干預和尋找有效的治療有著積極意義。
　　 近年來人們對CD4+T細胞抗腫瘤免疫的作用給予了很大的關注。在抗原的刺激下，CD4+T細胞亞

4、群被誘導分化分為效應T細胞和調節(jié)性T細胞兩類，效應T細胞因產生的細胞因子不同被分為若干亞群：Th1細胞，由IL-12誘導分化，產生主要的細胞因子是IFN-γ介導機體的細胞免疫；Th2細胞由IL-4誘導分化，主要產生IL-4、IL-5等細胞因子介導機體的體液免疫。此外，還有Th17細胞、Tfh細胞和Th9細胞等，其中產生IL-17的Th17細胞與各種免疫炎癥的發(fā)生密切相關，在各種變態(tài)反應和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。調節(jié)性T細胞(reg

5、ulatory T cells，Treg)是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，在維持機體免疫穩(wěn)定、調控免疫應答方面起重要的作用。Treg細胞的免疫無能和免疫抑制使得腫瘤免疫逃逸，進而導致機體對腫瘤的免疫無應答或免疫耐受。同時患者體內的腫瘤微環(huán)境能產生大量的特異性趨化因子，招募相應的免疫細胞到達腫瘤組織中，進而產生大量的細胞因子、生長因子、脂質信號等抑制機體的抗腫瘤免疫效應，增強腫瘤細胞的存活能力，促進腫瘤的生長。因此，腫瘤免疫治療已成為

6、當今腫瘤治療的一個熱點。
　　 CD4+T細胞各亞群功能狀態(tài)在宮頸癌患者體內的平衡狀況及與疾病預后的關系，目前研究較少。研究分析患者機體內環(huán)境中相關免疫細胞及有關的細胞因子和轉錄因子的變化以及可能機制，能為宮頸癌的臨床監(jiān)測和免疫治療提供新的思路。
　　 目的：
　　 1.了解宮頸癌患者外周血和腫瘤組織中CD4+T細胞相關亞群的比例，分析其相關轉錄因子和細胞因子的表達水平，同時以Th17細胞為靶標，考察Th17細胞

7、表面趨化因子受體及腫瘤組織中相應配體的表達情況，探討Th17細胞與宮頸癌臨床、病理分期的關系。
　　 2.通過觀察Th1/Th2細胞、Th17/Th1細胞、Th17/Treg細胞的平衡狀態(tài)，初步了解宮頸癌患者機體的免疫微環(huán)境，為從免疫失衡調節(jié)的角度認識疾病發(fā)生發(fā)展的規(guī)律和尋找免疫干預途徑奠定基礎。
　　 3.通過檢測TLR7、TLR8和TLR9在宮頸癌的表達、分析TLR8的表達與Bcl-2、VEGF的相互關系，以便進一步

8、探討宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中TLR8與CD4+T細胞亞群平衡失調的關系及可能機制打下基礎。
　　 方法：
　　 1.臨床病例分組及標本采集。
　　 2.用流式細胞術檢測宮頸癌患者外周血及腫瘤組織中Th1、Th2比率。分離單個核細胞，經重懸然后加入刺激劑(佛波酯和離子霉素)刺激細胞，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱，刺激培養(yǎng)5小時，流式細胞儀分析熒光抗體染色結果(抗人CD3-APC、抗人CD8-Percpcy5.5、抗人CD

9、45-FITC等)；同時進行細胞內細胞因子分析。
　　 以CD3+CD8-IFN-γ+T和CD45+CD3+CD8-IFN-γ+T細胞分別表示外周血和組織中的Th1細胞比例，以CD3+CD8-IL-4+和CD45+CD3+CD8-IL-4+T細胞分別表示外周血和組織中的Th2細胞比例。
　　 3.檢測Th17細胞在宮頸癌中的表達及其宮頸癌發(fā)病中的作用。免疫組化檢測IL-17在早、晚期宮頸癌組織中的表達。流式細胞術檢測宮頸

10、癌患者外周血Th17細胞及Th17細胞表面趨化因子受體CCR5、CXCR4和CCR6的表達：QRT-PCR檢測宮頸癌患者外周血中RORγt mRNA、IL-17 mRNA和腫瘤組織中趨化因子的表達水平：常規(guī)提取外周血和腫瘤組織中單個核細胞總RNA并逆轉錄為cDNA后，用實時定量PCR儀檢測并計算表達量。
　　 4.流式細胞術檢測Treg細胞。完成單個核細胞膜表面和細胞內熒光抗體染色后，流式細胞儀分析，以CD4+FoxP3+和CD

11、45+CD4+FoxP3+分別表示外周血、腫瘤組織中的Treg細胞比例。
　　 5.免疫熒光法檢測宮頸癌細胞系(Hela細胞)TLR8的表達情況：加入TLR8特異性抗體，37℃孵育3h，加入Hochest33258染色，熒光顯微鏡觀察。Real-timePCR檢測宮頸癌患者TLR7、8、9及Bcl-2、VEGF mRNA表達水平。
　　 結果：
　　 1.宮頸癌患者外周血中Th1細胞水平明顯降低，Th2細胞比率無

12、顯著性變化，外周血中Th1/Th2比值與對照組相比比值明顯下降(P<0.05)，腫瘤組織局部Th1/Th2比值與對照組相比未見明顯差異(P>0.05)。
　　 2.Th17細胞檢測結果：
　　 （1)免疫組化法檢測IL-17在腫瘤組織中表達的結果顯示，隨著宮頸癌疾病的進展，IL-17在局部腫瘤組織中的表達水平呈上升趨勢。
　　 （2)QRT-PCR檢測患者外周血中Th17細胞的特異性轉錄因子RORγ tmRNA和

13、主要細胞因子IL-17mRNA的表達水平，均顯著高于健康對照(P<0.01，P<0.05)，其中晚期宮頸癌患者比率最高，健康對照組最低，早期宮頸癌組介于兩者之間。
　　 （3)流式細胞術分析結果表明，患者外周血中Th17細胞(CD3+CD8-IL-17+T細胞)比率明顯高于對照組(P<0.05)；同時，腫瘤組織中Th17細胞比率也顯著高于對照組(P<0.05)，患者外周血和局部腫瘤組織呈現Th17細胞的優(yōu)勢表達。
　　

14、（4)Th17與Th1細胞的相關性分析，未發(fā)現宮頸癌患者外周血中兩種細胞有明顯的相關性，而在腫瘤發(fā)生發(fā)展的一定階段，腫瘤組織中Th17細胞和Th1細胞間呈明顯的負相關。
　　 （5)Th17細胞表面趨化因子受體：患者腫瘤組織中CCR5、CXCR4的表達雖有變化，但無統(tǒng)計學意義，而CCR6表達顯著升高。RT-PCR檢測腫瘤組織中CCR5、CCR6、CXCR4相應配體的結果顯示，CCR6的配體CCL20的mRNA表達明顯增加，而RA

15、NTES、CXCL12的表達無顯著差異。
　　 3.Treg細胞的檢測結果：
　　 （1)宮頸癌患者外周血、腫瘤組織中的Treg細胞比例均高于健康對照組(P<0.01)。
　　 （2)不同期別腫瘤中Th17/Treg比值隨著宮頸癌病程進展有差異，晚期宮頸癌的Th17/Treg細胞比值顯著低于早期宮頸癌(P<0.01)；相關性分析表明，Th17與Treg呈負相關(P<0.05)。
　　 4.TLR8檢測結果

16、
　　 （1)Real-timePCR檢測結果顯示，Hela細胞中呈現高TLR8 mRNA轉錄水平；熒光抗體染色呈現相似的結果，表達率近100％，TLR8蛋白定位于Hela細胞的胞漿內。
　　 （2)宮頸癌組織中TLR7、TLR8、Bcl-2和VEGF表達顯著高于健康對照組(P<0.05)，而TLR9的表達水平與健康對照組之間沒有明顯差異(P>0.05)。腫瘤組織中Bcl-2、VEGF與TLR8 mRNA水平的變化呈正相

17、關，而與TLR7 mRNA無相關性。
　　 結論：
　　 1.宮頸癌患者外周血Th1細胞水平和Th1/Th2比值明顯降低，表明Th1細胞介導的抗腫瘤效應受到抑制，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系。腫瘤組織中的Th1/Th2比值并未發(fā)現明顯改變，提示機體整體免疫狀態(tài)與癌癥組織局部免疫微環(huán)境并非完全一致，可能與疾病發(fā)展的時空差異或免疫細胞的組織遷移能力相關。
　　 2.免疫組化、QRT-PCR、流式細胞術等檢測手段均顯

18、示，宮頸癌患者外周血和腫瘤組織中Th17細胞均明顯增加，整體呈現Th17高表達狀態(tài)，且隨著病程的發(fā)展，Th17細胞呈繼續(xù)升高趨勢。同時患者癌組織中的Th17細胞顯著增高，可能系Th17細胞高表達趨化因子受體CCR6，而在癌組織中存在高表達的CCR6配體CCL20之故。提示，宮頸癌患者Th17細胞傾向于向腫瘤組織中聚集，有可能成為構成宮頸痛晚期腫瘤微環(huán)境的特點之一。
　　 3.宮頸癌患者Treg細胞水平增加，且在宮頸癌后期，隨著T

19、reg細胞水平的升高Th17/Treg細胞的比值顯著降低，兩者呈明顯負相關。Th17/Treg細胞比值可作為臨床監(jiān)測宮頸癌病情及判斷預后的免疫指標。
　　 4.分析了宮頸癌細胞表面的Toll樣受體。結果表明，腫瘤細胞表達TLR8，尤以宮頸癌Hela細胞系為著，宮頸癌患者組織中TLR7、TLR8表達顯著增高且腫瘤組織中Bcl-2、VEGF的升高與TLR8 mRNA水平的變化呈正相關。提示TLR8的表達與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能存在著一