CD4+T細(xì)胞平衡失調(diào)與宮頸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究.pdf

1、宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的疾病之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，位于女性惡性腫瘤的第二。近年來隨著人們思維方式和生活理念的變化，宮頸癌的發(fā)病率有明顯上升趨勢，發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化。目前宮頸癌的病因尚未完全明了，與宮頸癌發(fā)病相關(guān)的因素很多，初次性交年齡過小、男或女方多個(gè)性伴侶、免疫力低下及宮頸慢性炎癥等良性疾病被認(rèn)為是宮頸癌的重要危險(xiǎn)因素。其他如吸煙、口服避孕藥、多孕多產(chǎn)、教育程度低、經(jīng)濟(jì)狀況差和營養(yǎng)不良等也被認(rèn)為是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)因素。已有研

2、究報(bào)道，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體炎癥感染密切相關(guān)，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，90％以上的宮頸癌患者伴有人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)感染，在HPV病毒持續(xù)存在的情況下，多種因素的共同作用破壞了宮頸上皮細(xì)胞，并誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答平衡失調(diào)?？梢哉J(rèn)為，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染被認(rèn)為是重要的危險(xiǎn)因素之一，目前幾乎所有的流行病學(xué)調(diào)查均顯示高危型HPV感染，是宮頸癌及癌前病變發(fā)病的主要條件。宮頸癌患者機(jī)體內(nèi)免疫微環(huán)境的

3、變化也越來越受到重視。由于HPV感染所致宮頸病變直至發(fā)展為宮頸癌的自然史較長，在漫長的病程中，患者體內(nèi)免疫功能狀態(tài)如何?自身的免疫系統(tǒng)如何清除病毒感染等都有待研究。近些年關(guān)于腫瘤免疫的研究表明，腫瘤患者有著免疫調(diào)節(jié)異常所產(chǎn)生的免疫抑制狀態(tài)，因此，深入研究宮頸癌患者的免疫抑制機(jī)制，探討基于免疫調(diào)控的干預(yù)和尋找有效的治療有著積極意義。
　　 近年來人們對CD4+T細(xì)胞抗腫瘤免疫的作用給予了很大的關(guān)注。在抗原的刺激下，CD4+T細(xì)胞亞

4、群被誘導(dǎo)分化分為效應(yīng)T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞兩類，效應(yīng)T細(xì)胞因產(chǎn)生的細(xì)胞因子不同被分為若干亞群：Th1細(xì)胞，由IL-12誘導(dǎo)分化，產(chǎn)生主要的細(xì)胞因子是IFN-γ介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞由IL-4誘導(dǎo)分化，主要產(chǎn)生IL-4、IL-5等細(xì)胞因子介導(dǎo)機(jī)體的體液免疫。此外，還有Th17細(xì)胞、Tfh細(xì)胞和Th9細(xì)胞等，其中產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞與各種免疫炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，在各種變態(tài)反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(reg

5、ulatory T cells，Treg)是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，在維持機(jī)體免疫穩(wěn)定、調(diào)控免疫應(yīng)答方面起重要的作用。Treg細(xì)胞的免疫無能和免疫抑制使得腫瘤免疫逃逸，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體對腫瘤的免疫無應(yīng)答或免疫耐受。同時(shí)患者體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境能產(chǎn)生大量的特異性趨化因子，招募相應(yīng)的免疫細(xì)胞到達(dá)腫瘤組織中，進(jìn)而產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子、生長因子、脂質(zhì)信號(hào)等抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力，促進(jìn)腫瘤的生長。因此，腫瘤免疫治療已成為

6、當(dāng)今腫瘤治療的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　 CD4+T細(xì)胞各亞群功能狀態(tài)在宮頸癌患者體內(nèi)的平衡狀況及與疾病預(yù)后的關(guān)系，目前研究較少。研究分析患者機(jī)體內(nèi)環(huán)境中相關(guān)免疫細(xì)胞及有關(guān)的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的變化以及可能機(jī)制，能為宮頸癌的臨床監(jiān)測和免疫治療提供新的思路。
　　 目的：
　　 1.了解宮頸癌患者外周血和腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞相關(guān)亞群的比例，分析其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的表達(dá)水平，同時(shí)以Th17細(xì)胞為靶標(biāo)，考察Th17細(xì)胞

7、表面趨化因子受體及腫瘤組織中相應(yīng)配體的表達(dá)情況，探討Th17細(xì)胞與宮頸癌臨床、病理分期的關(guān)系。
　　 2.通過觀察Th1/Th2細(xì)胞、Th17/Th1細(xì)胞、Th17/Treg細(xì)胞的平衡狀態(tài)，初步了解宮頸癌患者機(jī)體的免疫微環(huán)境，為從免疫失衡調(diào)節(jié)的角度認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生發(fā)展的規(guī)律和尋找免疫干預(yù)途徑奠定基礎(chǔ)。
　　 3.通過檢測TLR7、TLR8和TLR9在宮頸癌的表達(dá)、分析TLR8的表達(dá)與Bcl-2、VEGF的相互關(guān)系，以便進(jìn)一步

8、探討宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中TLR8與CD4+T細(xì)胞亞群平衡失調(diào)的關(guān)系及可能機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.臨床病例分組及標(biāo)本采集。
　　 2.用流式細(xì)胞術(shù)檢測宮頸癌患者外周血及腫瘤組織中Th1、Th2比率。分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)重懸然后加入刺激劑(佛波酯和離子霉素)刺激細(xì)胞，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱，刺激培養(yǎng)5小時(shí)，流式細(xì)胞儀分析熒光抗體染色結(jié)果(抗人CD3-APC、抗人CD8-Percpcy5.5、抗人CD

9、45-FITC等)；同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分析。
　　 以CD3+CD8-IFN-γ+T和CD45+CD3+CD8-IFN-γ+T細(xì)胞分別表示外周血和組織中的Th1細(xì)胞比例，以CD3+CD8-IL-4+和CD45+CD3+CD8-IL-4+T細(xì)胞分別表示外周血和組織中的Th2細(xì)胞比例。
　　 3.檢測Th17細(xì)胞在宮頸癌中的表達(dá)及其宮頸癌發(fā)病中的作用。免疫組化檢測IL-17在早、晚期宮頸癌組織中的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測宮頸

10、癌患者外周血Th17細(xì)胞及Th17細(xì)胞表面趨化因子受體CCR5、CXCR4和CCR6的表達(dá)：QRT-PCR檢測宮頸癌患者外周血中RORγt mRNA、IL-17 mRNA和腫瘤組織中趨化因子的表達(dá)水平：常規(guī)提取外周血和腫瘤組織中單個(gè)核細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測并計(jì)算表達(dá)量。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg細(xì)胞。完成單個(gè)核細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)熒光抗體染色后，流式細(xì)胞儀分析，以CD4+FoxP3+和CD

11、45+CD4+FoxP3+分別表示外周血、腫瘤組織中的Treg細(xì)胞比例。
　　 5.免疫熒光法檢測宮頸癌細(xì)胞系(Hela細(xì)胞)TLR8的表達(dá)情況：加入TLR8特異性抗體，37℃孵育3h，加入Hochest33258染色，熒光顯微鏡觀察。Real-timePCR檢測宮頸癌患者TLR7、8、9及Bcl-2、VEGF mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.宮頸癌患者外周血中Th1細(xì)胞水平明顯降低，Th2細(xì)胞比率無

12、顯著性變化，外周血中Th1/Th2比值與對照組相比比值明顯下降(P<0.05)，腫瘤組織局部Th1/Th2比值與對照組相比未見明顯差異(P>0.05)。
　　 2.Th17細(xì)胞檢測結(jié)果：
　　 （1)免疫組化法檢測IL-17在腫瘤組織中表達(dá)的結(jié)果顯示，隨著宮頸癌疾病的進(jìn)展，IL-17在局部腫瘤組織中的表達(dá)水平呈上升趨勢。
　　 （2)QRT-PCR檢測患者外周血中Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγ tmRNA和

13、主要細(xì)胞因子IL-17mRNA的表達(dá)水平，均顯著高于健康對照(P<0.01，P<0.05)，其中晚期宮頸癌患者比率最高，健康對照組最低，早期宮頸癌組介于兩者之間。
　　 （3)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，患者外周血中Th17細(xì)胞(CD3+CD8-IL-17+T細(xì)胞)比率明顯高于對照組(P<0.05)；同時(shí)，腫瘤組織中Th17細(xì)胞比率也顯著高于對照組(P<0.05)，患者外周血和局部腫瘤組織呈現(xiàn)Th17細(xì)胞的優(yōu)勢表達(dá)。
　　

14、（4)Th17與Th1細(xì)胞的相關(guān)性分析，未發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者外周血中兩種細(xì)胞有明顯的相關(guān)性，而在腫瘤發(fā)生發(fā)展的一定階段，腫瘤組織中Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞間呈明顯的負(fù)相關(guān)。
　　 （5)Th17細(xì)胞表面趨化因子受體：患者腫瘤組織中CCR5、CXCR4的表達(dá)雖有變化，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CCR6表達(dá)顯著升高。RT-PCR檢測腫瘤組織中CCR5、CCR6、CXCR4相應(yīng)配體的結(jié)果顯示，CCR6的配體CCL20的mRNA表達(dá)明顯增加，而RA

15、NTES、CXCL12的表達(dá)無顯著差異。
　　 3.Treg細(xì)胞的檢測結(jié)果：
　　 （1)宮頸癌患者外周血、腫瘤組織中的Treg細(xì)胞比例均高于健康對照組(P<0.01)。
　　 （2)不同期別腫瘤中Th17/Treg比值隨著宮頸癌病程進(jìn)展有差異，晚期宮頸癌的Th17/Treg細(xì)胞比值顯著低于早期宮頸癌(P<0.01)；相關(guān)性分析表明，Th17與Treg呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。
　　 4.TLR8檢測結(jié)果

16、
　　 （1)Real-timePCR檢測結(jié)果顯示，Hela細(xì)胞中呈現(xiàn)高TLR8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平；熒光抗體染色呈現(xiàn)相似的結(jié)果，表達(dá)率近100％，TLR8蛋白定位于Hela細(xì)胞的胞漿內(nèi)。
　　 （2)宮頸癌組織中TLR7、TLR8、Bcl-2和VEGF表達(dá)顯著高于健康對照組(P<0.05)，而TLR9的表達(dá)水平與健康對照組之間沒有明顯差異(P>0.05)。腫瘤組織中Bcl-2、VEGF與TLR8 mRNA水平的變化呈正相

17、關(guān)，而與TLR7 mRNA無相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1.宮頸癌患者外周血Th1細(xì)胞水平和Th1/Th2比值明顯降低，表明Th1細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)受到抑制，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。腫瘤組織中的Th1/Th2比值并未發(fā)現(xiàn)明顯改變，提示機(jī)體整體免疫狀態(tài)與癌癥組織局部免疫微環(huán)境并非完全一致，可能與疾病發(fā)展的時(shí)空差異或免疫細(xì)胞的組織遷移能力相關(guān)。
　　 2.免疫組化、QRT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)等檢測手段均顯

18、示，宮頸癌患者外周血和腫瘤組織中Th17細(xì)胞均明顯增加，整體呈現(xiàn)Th17高表達(dá)狀態(tài)，且隨著病程的發(fā)展，Th17細(xì)胞呈繼續(xù)升高趨勢。同時(shí)患者癌組織中的Th17細(xì)胞顯著增高，可能系Th17細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體CCR6，而在癌組織中存在高表達(dá)的CCR6配體CCL20之故。提示，宮頸癌患者Th17細(xì)胞傾向于向腫瘤組織中聚集，有可能成為構(gòu)成宮頸痛晚期腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)之一。
　　 3.宮頸癌患者Treg細(xì)胞水平增加，且在宮頸癌后期，隨著T

19、reg細(xì)胞水平的升高Th17/Treg細(xì)胞的比值顯著降低，兩者呈明顯負(fù)相關(guān)。Th17/Treg細(xì)胞比值可作為臨床監(jiān)測宮頸癌病情及判斷預(yù)后的免疫指標(biāo)。
　　 4.分析了宮頸癌細(xì)胞表面的Toll樣受體。結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞表達(dá)TLR8，尤以宮頸癌Hela細(xì)胞系為著，宮頸癌患者組織中TLR7、TLR8表達(dá)顯著增高且腫瘤組織中Bcl-2、VEGF的升高與TLR8 mRNA水平的變化呈正相關(guān)。提示TLR8的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能存在著一