負(fù)載BMP-7基因的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 脊柱融合術(shù)是目前骨科醫(yī)生常用的術(shù)式之一，但融合失敗率較高。目前設(shè)計(jì)的內(nèi)固定器械可以保證脊柱的即刻穩(wěn)定性，提供植骨融合所需的力學(xué)環(huán)境，但脊柱的長期穩(wěn)定最終還要依靠骨性融合。脊柱融合術(shù)中自體骨移植通常被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是脊柱融合需要較大的植骨量而自體骨來源有限，并且會(huì)對(duì)供體造成新的損害，常會(huì)伴有供區(qū)疼痛、神經(jīng)損傷、骨折、感染等并發(fā)癥。而異體骨具有免疫原性，而且存在傳染疾病等潛在危險(xiǎn)。影響脊柱骨性融合的因素有很多，許多研究

2、希望通過尋找高性能的自體骨替代材料促進(jìn)脊柱融合。由支架材料、種子細(xì)胞和生長因子復(fù)合構(gòu)建的組織工程骨作為一種理想的自體骨組織替代物，有希望通過骨誘導(dǎo)方式促進(jìn)脊柱融合，成為目前骨科研究熱點(diǎn)之一。 采用Ⅰ型膠原酶消化法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，對(duì)存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)和體外擴(kuò)增，運(yùn)用免疫表型和誘導(dǎo)分化相結(jié)合的方法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染將BMP-7基因轉(zhuǎn)入ADSCs，篩選穩(wěn)定

3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過BMP-7基因轉(zhuǎn)染ADSCs促使其向成骨細(xì)胞分化，并過測定Ⅰ型膠原是否穩(wěn)定表達(dá)來判斷，為探索一種具有成骨誘導(dǎo)生物活性、促進(jìn)脊柱融合的自體骨替代新材料奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料與方法: 一、實(shí)驗(yàn)材料 新西蘭大白兔，中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。 二、實(shí)驗(yàn)方法 (一)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 1、兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)采用Ⅰ型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法，分離、純化兔脂肪間充質(zhì)

4、干細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。 2、兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定CD44、CD49d、CD106檢測細(xì)胞免疫表型。 向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)：10-8mol/L地塞米松、50μmol/L-抗壞血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的成骨誘導(dǎo)液中。 3、生物學(xué)性狀的觀察用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞的生長情況并拍照。繪制第2代ADSCs細(xì)胞生長曲線。 (二)BMP-7基因轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究 1

5、、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-7的重構(gòu)、擴(kuò)增純化及鑒定。 2、建立穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-BMP-7-ADSCs細(xì)胞株，RT-PCR檢測BMP-7表達(dá)。 3、相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并免疫熒光檢測Ⅰ型膠原的表達(dá)。 結(jié)果: (一)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)成功 1、Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織后所分離得到的細(xì)胞大多為圓形單個(gè)核細(xì)胞，貼壁生長后原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞生長狀態(tài)良好。各代細(xì)胞形

6、態(tài)基本一致，都為長梭形。 2、細(xì)胞免疫表型檢測細(xì)胞膜表達(dá)CD44、CD49d陽性而CD106的表達(dá)為陰性。地塞米松、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)組ALP、茜素紅染色呈陽性。 3、繪制第2代ADSCs細(xì)胞生長曲線，通過分析可以看出ADSCs的增殖符合干細(xì)胞增殖規(guī)律，其增殖速度較快。 (二)通過BMP-7基因誘導(dǎo)，ADSCs成功誘導(dǎo)分化成骨樣細(xì)胞 1、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-7重構(gòu)、擴(kuò)增純化

7、及鑒定成功。 2、成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-7-ADSCs細(xì)胞株。 3、BMP-7基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞仍具有較高的增殖能力。 4、BMP-7基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)Ⅰ型膠原，且表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量增高。 結(jié)論: l、通過Ⅰ型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法在體外能夠成功培養(yǎng)出增殖能力強(qiáng)的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，可以作為組織工程的種子細(xì)胞。 2、經(jīng)BMP-7基因修飾后的ADSC