XPD對SMMC-7721肝癌細胞中DNp73和GADD45β的調控及意義.pdf

1、目的:
　　通過將著色性干皮病D組基因(XPD，xeroderma pigmentosum group D)轉染人SMMC-7721肝癌細胞后，觀察XPD、GADD45β和DNp73基因mRNA和蛋白的表達變化;以及對人SMMC-7721肝癌細胞生長和凋亡的影響。
　　方法:
　　1、用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)SMMC-7721肝癌細胞，并置于37℃、5％CO2的孵箱內培養(yǎng)。
　　2、通過Lipofe

2、ctamine2000進行瞬時轉染重組質粒pEGFP-N2-XPD、pEGFP-N2至SMMC-7721肝癌細胞內。實驗分四組:XPD組、N2組、脂質體組和空白對照組，轉染后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染結果。
　　3、設計并化學合成預檢測基因的PCR引物:XPD、DNp73、GADD45β;收集各轉染組及空白對照組SMMC-7721肝癌細胞，提取RNA并利用RT-PCR檢測XPD、DNp73、GADD45β在各組細胞中的RNA表達水

3、平;用Band Leader3.0圖像分析軟件進行灰度分析。
　　4、收集各轉染組及空白對照組SMMC-7721肝癌細胞，提取蛋白并利用Western blotting檢測XPD、DNp73、GADD45β在各組細胞中的蛋白表達水平;用Quantity One圖像分析軟件進行灰度分析。
　　5、利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測各組細胞的細胞增殖力。
　　6、利用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率:四組細胞經(jīng)0.25％胰酶消

4、化后采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒進行流式細胞儀檢測。
　　7、運用SPSS13.0進行分析，用均數(shù)±標準差表示資料，單因素方差分析用于組間比較，LSD檢驗用于兩兩比較。
　　結果:
　　1、轉染:顯微鏡下見N2組和XPD組的細胞中有綠色熒光蛋白(GFP)的表達，然而空白組和脂質體組的細胞則未見表達。
　　2、RT-PCR檢測:XPD組細胞內XPD和GADD45β的mRNA表達量均高于其他三組

5、，而DNp73的mRNA表達量低于其他三組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。XPD、GADD45β和DNp73的mRNAs表達量在N2組、脂質體組和空白對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3、Western blotting檢測: XPD組細胞內XPD和GADD45β的蛋白表達量高于其他三組，DNp73的蛋白表達量低于其他三組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。XPD、GADD45β和DNp73的蛋白表達水平在N2

6、組、脂質體組和對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　4、MTT法檢測細胞增殖活力:XPD組的細胞增殖力明顯低于其他三組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　5、流式細胞儀檢測細胞凋亡率:轉染pEGFP-N2-XPD重組質粒的細胞凋亡較其他三組顯著，凋亡達56.53％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　結論:
　　XPD具有抑制人肝癌細胞增殖和促進其凋亡的作用，其作用機制之一是通過抑制癌基因和