水牛性別控制相關(guān)問題的研究.pdf

1、中國擁有超過兩千萬頭沼澤型水牛，但絕大多數(shù)只能作為役用，若能通過性別控制技術(shù)將其快速改良成乳用或乳肉兼用的雜交水牛，將能帶來巨大的經(jīng)濟和社會效益。本論文利用流式細胞儀分離水牛x和Y精子法進行水牛性別控制研究，以期建立和完善水牛性別控制技術(shù)體系，并應(yīng)用到水牛繁殖、育種的研究和生產(chǎn)實踐，加速水牛品種改良工作進展。具體研究內(nèi)容分為如下五個部分： 研究一，分析和鑒定水牛X精子和Y精子DNA含量的差異，為進行分離水牛XY精子性別控制研究提

2、供理論基礎(chǔ)。 研究結(jié)果顯示，摩拉水牛的x精子和Y精子的DNA含量差別為3.59±0.11％，尼里一拉菲水牛X精子和Y精子的DNA含量差別為3.55±0.14％，兩個品種之間沒有顯著差異(P>0.05)，但是品種內(nèi)的牛個體之間有差異(P<0.05)。本研究結(jié)果揭示了水牛XY精子DNA含量差異，同時表明了分離的可行性。 研究二，對水牛精子分離之后的體外存活能力、項體完整情況及微生物污染等精液品質(zhì)相關(guān)參數(shù)進行系統(tǒng)分析，以了解影

3、響水牛分離精子活率和受精能力的因素，為改進水牛精子分離方法及提高其在IVF和AI應(yīng)用效率提供參考。 研究結(jié)果表明，流式細胞儀法、熒光顯微鏡法與精子圖像分析儀法檢測所得精子活率的相關(guān)系數(shù)大于0.85，相關(guān)性非常顯著，表明均能有效評定精子活率。對分離精子品質(zhì)分析結(jié)果表明，新鮮水牛精子經(jīng)過分離后，死亡精子被去除，活精子率從分離前的72.4％提高到了86.4％(P<0.05)。經(jīng)過冷凍解凍后，分離精子的活率高于未分離精子的活率(44.1

4、％ vs 33.9％，P<0.05)；體外孵育3h、6h后，分離精子活精子率分別為24.2％、15.6％，未分離精子活精子率分別為9.0％、6.7％，二者均下降明顯(P<0.05)，而同一孵育時間的分離精子活率均高于未分離精子活率(P<0.05)。在頂體反應(yīng)方面，新鮮水牛精子經(jīng)過分離后，頂體損壞的精子也被去除，發(fā)生頂體反應(yīng)精子的比例從分離前的22.9％減少到分離后3.9％(P<0.05)，但是經(jīng)過冷凍解凍后增加到30.0％，與未分離冷凍

5、精子的26.8％沒有顯著差異(P>0.05)，表明分離精子受冷凍損傷更嚴重。解凍并體外孵育3h、6h后，分離精子項體反應(yīng)比例分別為33.9％、38.3％，未分離精子頂體反應(yīng)比例分別為32.8％、35.6％，同一孵育時間的分離精子頂體反應(yīng)率稍微高于未分離精子，但無統(tǒng)計差異(P>0.05)。 精液微生物分析試驗結(jié)果表明，新鮮采集的水牛精液平均菌落密度10619個/毫升，常規(guī)凍精平均菌落密度為293個/毫升，而分離冷凍精液平均菌落密度

6、達到18935個/毫升，三者差異顯著(P<0.05)。新鮮精液檢測到的菌落中，革蘭氏陽性球菌占48％，陰性桿菌占41％，陽性桿菌占9％，霉菌占2％；而分離精子冷凍精液中的菌落100％為革蘭氏陰性桿菌，經(jīng)檢測確定為陰溝腸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌，對妥布霉素和慶大霉素呈耐藥性，而對丁胺卡那霉素以及環(huán)丙氟哌酸藥物敏感性較強。 研究三，通過制作奶牛性染色體涂染探針，檢測水牛分離精子的純度，以期建立一種獨立評估水牛分離精子純度的手段。

7、 研究結(jié)果表明，運用顯微操作儀能夠有效分離荷斯坦奶牛的性染色體并制作探針。應(yīng)用荷斯坦奶牛Y染色體探針雜交水牛正常精子顯示，Y精子比例為47.7％；應(yīng)用荷斯坦奶牛X染色體探針雜交水牛正常精子顯示，X精子比例為48.9％，二者均接近50％理論值(P>0.05)，表明所制備染色體探針用于鑒定XY精子比例的有效性。在雜交水牛分離精子中，應(yīng)用Y染色體探針雜交水牛分離Y精子樣本表明，Y精子所占的比率為82.2％；應(yīng)用X染色體探針雜交水牛分離Y精子樣

8、本表明，X精子所占比例為9.6％，也即Y精子所占的比率為90.4％。兩種探針檢測分離Y精子的綜合純度為86.2％，與流式細胞儀重分析87％的結(jié)果接近(P>0.05)。 研究四，將水牛分離精子應(yīng)用于活體采卵(OPU)和體外受精(IVF)技術(shù)體系，以提高水牛分離精子生產(chǎn)優(yōu)良性控胚胎和后代的效率。 試驗結(jié)果表明，在水牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中添加瘦素不但能有效促進水牛卵母細胞成熟，而且提高其體外成熟的質(zhì)量及受精后的胚胎發(fā)育潛能，

9、其中以成熟培養(yǎng)液中添加10ng/mL的效果最為明顯，卵母細胞成熟后極體排出率達到61.2％，IvF囊胚發(fā)育率達到22.4％，與不添加瘦素的對照組51.9％的極體排出率和13.0％的囊胚率均有顯著差異(P<0.05)。研究還發(fā)現(xiàn)，在胚胎培養(yǎng)液中添加瘦素有助于促進水牛IVF胚胎的發(fā)育，其中以10ng/mL的效果最為明顯，囊胚發(fā)育率達到26.1％，與不添加瘦素的對照組17.5％的囊胚率有顯著差異(P<0.05)。此外，在成熟液和胚胎培養(yǎng)液中同

10、時添加10ng/mL的瘦素，IVF囊胚發(fā)育達到27.0％，與對照組19.7％的囊胚率差異顯著(P<0.05)。但在分離精子IVF時，在成熟液和胚胎培養(yǎng)液中同時添加10ng/mL的瘦素，雖然IVF后卵母細胞的分裂率和囊胚率都有一定提高，但是與對照組沒有統(tǒng)計差異(P>0.05)。 在OPU-IVF研究中，OPU得到的水牛卵母細胞與分離精子和未分離精子IVF后的分裂率分別為50.5％和50.9％，二者沒有顯著差異(P>0.05)；而分

11、離精子IVF后的囊胚率為15.3％，稍微低于未分離精子19.1％，但二者也沒有顯著差異(P>0.05)。分離和未分離精子與OPU來源卵母細胞．IVF生產(chǎn)的鮮胚移植受胎率分別為26.5％和26.9％，二者沒有顯著差異(P>0.05)；分離和未分離精子與OPU來源卵母細胞IVF生產(chǎn)的凍胚移植受胎率分別為11.6％和15.4％，二者也沒有顯著差異(P>0.05)。將分離精子和未分離精子生產(chǎn)的胚胎移植數(shù)據(jù)合并分析顯示，凍胚的總體受胎率(13.4

12、％)顯著低于鮮胚受胎率(26.7％，P<0.05)。未分離常規(guī)精子與OPU來源卵母細胞生產(chǎn)的體外胚胎移植后，產(chǎn)下10例正常水牛犢(6母，4公)，流產(chǎn)3例(3公)；分離X精子與OPU卵母細胞生產(chǎn)的體外性控胚胎移植后，產(chǎn)下11例正常水牛犢(10母，1公)，流產(chǎn)3例(2母，1公)，雌性率為85.7％，遠高于未分離精子46.1％(6/13)的雌性率(P<0.05)。 研究五，通過將水牛分離精子應(yīng)用于AI，并與荷斯坦牛分離精子AI相比較，

13、探討和分析水牛分離精子在AI中應(yīng)用的問題，以提高其利用效率，為利用分離精子性別控制技術(shù)加快水牛品種改良奠定基礎(chǔ)。 研究結(jié)果表明，在荷斯坦奶牛方面，分離和未分離的常規(guī)精子配種處女牛的受胎率分別為61.4％和61.3％(P>0.05)，配種經(jīng)產(chǎn)母牛的受胎率分別為42.9％和46.2％(P>0.05)；無論是分離精子還是常規(guī)精子，配種經(jīng)產(chǎn)母牛的受胎率均顯著低于處女牛(P<0.01)。在水牛方面，分離精子和常規(guī)精子配種水牛情期受胎率分別

14、為69.7％和66.5％，二者無顯著差異(P>0.05)；分離精子配種處女牛受胎率為77.8％，比配種經(jīng)產(chǎn)母牛67.6％的受胎率高，但沒有統(tǒng)計差異(P>0.05)；在流產(chǎn)率方而，水牛分離精子和常規(guī)精子配種妊娠后流產(chǎn)率都很低，二者沒有顯著差異(P>0.05)。而分離精子配種雜交水牛受胎率(85.7％)高于本地沼澤型水牛(62.1％)，但二者沒有統(tǒng)計差異(P>0.05)。 此外，本研究還表明，無論是荷斯坦奶牛還是水牛，不同公牛來源的

15、分離精子配種后受胎率差異顯著(P<0.05)；在不同管理條件下的母牛群進行分離精子配種的受胎率差異明顯(P<0.05)。 本研究中，利用分離精子總共配種荷斯坦奶牛306頭，受胎179頭，情期受胎率58.5％，流產(chǎn)7頭，產(chǎn)犢172頭，其中產(chǎn)母犢153頭，產(chǎn)犢性別準(zhǔn)確率89.0％；利用分離精子總共配種水牛65頭，妊娠35頭，情期受胎率53.8％，流產(chǎn)2頭，經(jīng)產(chǎn)下牛犢33頭，其中母犢28頭，產(chǎn)母犢性別準(zhǔn)確率84.8％。奶牛和水牛分離精