多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細胞凋亡及治療大鼠角膜堿燒傷的實驗研究.pdf

1、多西環(huán)素是一種半合成的四環(huán)素類抗生素，具有多方面的抗炎作用。近年來發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素可以誘導(dǎo)多種腫瘤細胞、人體細胞凋亡，其中有參與機體免疫反應(yīng)的細胞，我們推測誘導(dǎo)炎癥細胞凋亡可能是多西環(huán)素一個新的抗炎機制。本實驗以單核細胞系THP-1為細胞模型，探討多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細胞凋亡的作用及其機制，為多西環(huán)素抗炎作用提供理論依據(jù)。 角膜堿燒傷是嚴重的創(chuàng)傷性眼病，其病理過程復(fù)雜，病情嚴重，治療棘手，預(yù)后差，對人民健康和家庭社會經(jīng)濟造成嚴重影

2、響。炎癥和新生血管是影響角膜堿燒傷愈后的兩個重要病理過程。多西環(huán)素具有多方面的抗炎作用。近期研究表明多西環(huán)素對角膜新生血管也有抑制作用。本實驗以大鼠角膜堿燒傷為模型，研究多西環(huán)素眼液對角膜堿燒傷炎癥過程及新生血管形成的影響，探討多西環(huán)素治療角膜堿燒傷的機制。 第1章多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細胞凋亡的實驗研究。 目的：研究多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細胞凋亡的作用。 方法：以PMA誘導(dǎo)THP-1細胞分化貼壁，分別按5 mg

3、/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80mg/L的濃度梯度加入多西環(huán)素，作用12 h或48 h，設(shè)空白對照組。觀察細胞形態(tài)變化，采用MTT法檢測THP-1細胞活性，AnnexinV和PI雙染色后用流式細胞儀檢測THP-l細胞早期凋亡，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(TUNEL)檢測THP-1細胞晚期凋亡。 結(jié)果：隨著多西環(huán)素濃度增高，THP-1細胞收縮變圓，細胞間距增寬乃至完全分離，死亡、崩解

4、的THP-1細胞逐漸增多。MTT法顯示隨著多西環(huán)素作用濃度增高，活性THP-1細胞數(shù)量逐漸下降。流式細胞儀檢測和TUNEL檢測顯示THP-1細胞的早期凋亡和晚期凋亡率均伴隨多西環(huán)素作用濃度的升高而升高。 結(jié)論：本實驗首次闡明多西環(huán)素可以誘導(dǎo)人THP-1細胞凋亡，其效應(yīng)呈明顯的劑量依賴關(guān)系。 第2章多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細胞凋亡的機制研究。 目的：探討多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細胞凋亡的分子機制。 方法：以PM

5、A誘導(dǎo)THP-1細胞分化貼壁，按濃度梯度加入多西環(huán)素，設(shè)空白對照組，按實驗?zāi)康闹谱骷毎榔蚴占毎２捎妹庖呓M織化學方法檢測THP-1細胞的FasL表達情況。采用PI染色檢測THP-1細胞周期。Western blot檢測THP-1細胞核NF-κB含量。 結(jié)果：多西環(huán)素各個濃度處理組未發(fā)現(xiàn)THP-1細胞FasL表達增加。各個多西環(huán)素處理組和對照組的G1期、G2期及S期細胞百分率兩兩比較均無統(tǒng)計學差異。多西環(huán)素能抑制NF-κB

6、轉(zhuǎn)移至核內(nèi)發(fā)生生物學效應(yīng)，其效應(yīng)呈劑量依賴關(guān)系。 結(jié)論：多西環(huán)素可能通過抑制NF-κB活性誘導(dǎo)THP-1細胞凋亡。 第3章多西環(huán)素抑制堿燒傷大鼠角膜的炎癥細胞浸潤。 目的：研究多西環(huán)素抑制堿燒傷大鼠角膜炎癥反應(yīng)的作用及分子機制。 方法：制作大鼠角膜堿燒傷模型，設(shè)對照組、地塞米松組和多西環(huán)素組，分別點眼液溶媒、0.1﹪地塞米松眼液和0.5﹪多西環(huán)素眼液，于堿燒傷后第3、7、14、21天隨機取4只大鼠，誘導(dǎo)麻

7、醉后裂隙燈觀察照相，計算炎癥指數(shù)。隨后處死，角膜取材，一半角膜10﹪福爾馬林固定行病理組織切片，HE染色，進行炎癥細胞計數(shù)，另一半-80℃保存，備ELISA檢測。角膜組織病理切片行原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(TUNEL)檢測。 結(jié)果：各時間點多西環(huán)素組炎癥指數(shù)低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。多西環(huán)素抑制炎癥作用與地塞米松組比較無統(tǒng)計學差異。各時間點多西環(huán)素組炎癥細胞計數(shù)低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。多西

8、環(huán)素抑制炎癥細胞浸潤的作用與地塞米松組比較無統(tǒng)計學差異。各時間點多西環(huán)素組角膜ICAM-1濃度低于對照組，除第7天p值為0.072外，其余各組差異均具有統(tǒng)計學意義。地塞米松抑制ICAM-1表達的作用強于多西環(huán)素。角膜組織原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(TUNEL)檢測顯示，對照組偶有炎癥細胞凋亡，地塞米松組無炎癥細胞凋亡，多西環(huán)素組有明顯增多的炎癥細胞凋亡。 結(jié)論：多西環(huán)素可能通過降低ICAM-1的表達及誘導(dǎo)

9、炎癥細胞凋亡抑制堿燒傷大鼠角膜的炎癥細胞浸潤。 第4章多西環(huán)素抑制堿燒傷大鼠角膜的新生血管形成。 目的：研究多西環(huán)素抑制堿燒傷大鼠角膜新生血管形成的作用及可能機制。 方法：臍靜脈內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)及鑒定，加入梯度濃度的多西環(huán)素，觀察多西環(huán)素對臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖活性的影響。制作大鼠角膜堿燒傷模型，設(shè)對照組、地塞米松組和多西環(huán)素組，分別點眼液溶媒、0.1﹪地塞米松眼液和0.5﹪多西環(huán)素眼液，于堿燒傷后第3、7、14、

10、21天隨機取4只大鼠，誘導(dǎo)麻醉后裂隙燈觀察照相，計算炎癥指數(shù)及新生血管面積。隨后處死，角膜取材，一半角膜10﹪福爾馬林固定行病理組織切片，HE染色，進行炎癥細胞計數(shù)，另一半-80℃保存，備ELISA檢測。 結(jié)果：臍靜脈內(nèi)皮細胞陽性表達CD31和CD34。在多西環(huán)素作用下，臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖活性受到抑制，呈劑量依賴關(guān)系。各時間點多西環(huán)素組炎癥指數(shù)低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。多西環(huán)素抑制炎癥作用與地塞米松組比較無統(tǒng)計學差異。各時

11、間點多西環(huán)素組炎癥細胞計數(shù)低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。多西環(huán)素抑制炎癥細胞浸潤的作用與地塞米松組比較無統(tǒng)計學差異。地塞米松組和多西環(huán)素組的各時間點新生血管面積均小于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。地塞米松組第3、7天新生血管面積小于多西環(huán)素組，差異具有統(tǒng)計學意義。各組的新生血管面積與炎癥指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。多西環(huán)素組各時間點角膜VEGF表達低于對照組，差異無統(tǒng)計學意義。地塞米松組第3、7天角膜VEGF表達低于對照組，第14、21天表達高于