胃癌中DNA甲基化引起RASSF10表達沉默及臨床意義的研究.pdf

1、目的：
　　 腫瘤抑制基因的表達沉默在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,而DNA甲基化是腫瘤抑制基因表達沉默的主要原因之一。本文探討胃癌中RASSF10基因的表達水平及與啟動子區(qū)DNA甲基化的關系,以及DNA甲基化的改變在臨床中可能的應用價值。
　　 材料與方法：
　　 一、細胞株和胃癌及對應的癌旁非癌組織
　　 人正常胃粘膜上皮永生化細胞株GES-1和6個胃癌細胞株(SGC7901,BGC823,MGC803

2、,AGS,MKN45,HGC27),胃癌組織和對應的癌旁非癌組織共86對。
　　 二、實時定量RT-PCR
　　 上述7種細胞株培養(yǎng)收獲后以TRIzol處理并用氯仿一異丙醇提取RNA,用DnaseⅠ去除RNA中的DNA,然后行實時定量RT-PCR檢測RASSF10的表達,用2-△△Ct法分析實時定量PCR數(shù)據(jù),以GES-1中的表達量為相對標準,其他6個細胞株中的表達量與其比較。
　　 三、甲基化特異性PCR

3、>　　 DNA采取經(jīng)典的有機溶劑法提取,然后行重亞硫酸鈉修飾、純化、回收,回收的DNA用甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物分別行甲基化特異性PCR,對PCR結果進行電泳分析,判別每一個樣本中RASSF10基因啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài),分非甲基化(U)、部分甲基化(P)、高甲基化(M)三種狀態(tài)。部分MSP產(chǎn)物予以測序以判斷確切的甲基化狀態(tài)。
　　 四、藥物干預實驗
　　 以去甲基化藥物和/或組蛋白去乙?；敢种苿

4、KN45細胞株進行藥物于預,以不加任何一種藥物的MKN45作為對照組,其他應用任何一種藥物的為實驗組,完畢提取RNA并行實時定量RT-PCR檢測RASSF10的表達,以無藥物干預的對照組為相對標準,其他實驗組與其比較,用2-△△Ct法分析實時定量PCR數(shù)據(jù)。
　　 五、統(tǒng)計學分析
　　 將癌組織和癌旁非癌組織中RASSF10基因的甲基化狀態(tài)進行統(tǒng)計學分析,癌組織中RASSF10基因的甲基化狀態(tài)與其病理指標行統(tǒng)計學分析,實

5、驗數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包建立數(shù)據(jù)庫,進行卡方檢驗。P＜0.05時,有顯著性差異;P＞0.05時,無顯著性差異。
　　 結果：
　　 1、RASSF10在6株胃癌細胞株中的表達均下調(diào),去甲基化藥物和組蛋白去乙酰化酶抑制劑均可誘導RASSF10在btKN45中的表達,二者聯(lián)合時誘導作用更強。
　　 2、RASSF10基因的啟動子DNA在GES-1中為部分甲基化,而在6株胃癌細胞株中均為高甲基化。
　

6、　 3、RASSF10基因的啟動子在胃癌組織和相應的癌旁非癌組織中甲基化狀態(tài)存在明顯差異,前者甲基化頻率明顯高于后者(61.6%vs.38.4%,p=0.004)。癌組織中RASSF10基因的甲基化狀態(tài)與癌灶大小(＜10cmvs.≥10em,56.8%vs.91.7%,p＜0.05)、大體類型(EC42+BorrmannⅠ+BorrmannⅡ+BorrmannⅢvs.BorrmannⅣ,56.9%vs.85.7%,p＜0.05)、淋巴

7、結轉(zhuǎn)移(N0vs.N1+N2+N3,40.9%vs.68.75%,p＜0.05)、浸潤深度(T1+T2vs.T3+T4,37.5%vs.67.1%,p＜0.05)、腫瘤分期(Ⅰ期vs.Ⅱ期+Ⅲ期,20%vs.67.1%,p＜0.05)有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 RASSF10基因在胃癌中因啟動子區(qū)的DNA高甲基化和組蛋白去乙?；鸨磉_沉默,其啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)與胃癌的臨床病理指標有關,其DNA高甲基化可