選擇性磷酸二酯酶IV（PDE4）抑制劑Zl-n-91對(duì)人記性Th17細(xì)胞抑制作用的研究.pdf

1、Th17細(xì)胞，是一種新發(fā)現(xiàn)的能夠產(chǎn)生白介素-17(IL-17)的T輔助細(xì)胞亞型。Th17細(xì)胞具有高度的促炎癥性，并能夠誘導(dǎo)嚴(yán)重的自身免疫。大量證據(jù)表明IL-17與多種自身免疫性疾病的病理相關(guān)，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和克隆氏疾病。在動(dòng)物模型關(guān)節(jié)炎中，用抗體或可溶性的受體阻斷IL-17，能夠緩解炎性癥狀。 磷酸二酯酶是由催化環(huán)磷腺苷(cAMP)和環(huán)磷鳥苷(cGMP)水解成相應(yīng)的一磷酸鹽的酶蛋白超家族組成，在多種生

2、理功能中起重要作用。磷酸二酯酶抑制劑在多種炎癥性疾病包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、變應(yīng)性鼻炎和異位性皮炎中有效。選擇性磷酸二酯酶Ⅳ抑制劑(PDE4)通過抑制cAMP的水解而升高細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平，在臨床上已經(jīng)被證明是呼吸道炎癥性疾病的一種抗炎藥。在動(dòng)物模型中，關(guān)節(jié)炎和膿毒癥也是磷酸二酯酶抑制劑的適應(yīng)癥。 在目前的研究中，我們觀察了選擇性磷酸二酯酶Ⅳ抑制劑Zl-n-91對(duì)Th17細(xì)胞的作用。正常志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)

3、用抗CD3(anti-CD3)和抗CD28(anti-CD28)單克隆抗體刺激，加或不加Zl-n-91。IL-17水平用ELISA和RT-PCR的方法檢測(cè)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加入Zl-n-91能夠抑制anti-CD3／anti-CD28誘導(dǎo)的IL-17的產(chǎn)生，且這一抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)。相應(yīng)的半數(shù)抑制量(即抑制最大量的一半)在這個(gè)范圍內(nèi)：50-100μM。Zl-n-91同時(shí)抑制IL-17mRNA表達(dá)水平。純化的CD4+T細(xì)胞用anti

4、-CD3／anti-CD28刺激，加或不加Z1-n-91，結(jié)果顯示，Z1-n-91在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上抑制IL-17的產(chǎn)生和表達(dá)。流式結(jié)果表明Zl-n-91通過抑制CD4+T細(xì)胞活化、增殖和分裂來抑制記憶性Thl7細(xì)胞產(chǎn)生IL-17。我們的結(jié)果表明Zl-n-91可能在IL-17相關(guān)的自身免疫性疾病的治療中具有重大的應(yīng)用前景。 目的 探討選擇性磷酸二酯酶Ⅳ抑制劑Zl-n-91對(duì)記憶性Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的作用及其作用機(jī)

5、制。 方法 (1)肝素抗凝血用密度梯度離心法分離，獲得正常人PBMCs，加anti-CD3／anti-CD28共培養(yǎng)細(xì)胞，再加入不同濃度的Zl-n-91，用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17和IFN-γ產(chǎn)生的量，觀察Zl-n-91對(duì)PBMCs產(chǎn)牛IL-17和IFN-γ的影響。 (2)用磁珠分選法分離正常人PBMCs中的CD4+T細(xì)胞，用anti-CD3預(yù)先包被96孔板，再加入anti-CD28和不同濃度的Zl

6、-n-91，孵育3天后用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17和IFN-γ產(chǎn)生的量，觀察Zl-n-91對(duì)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17和IFN-γ的作用。 (3)用六孔板培養(yǎng)PBMCs，并加入anti-CD3／anti-CD28刺激細(xì)胞，或者用anti-CD3預(yù)先包被6孔板，再加入anti-CD28共培養(yǎng)磁珠分選出來的純化CD4+T細(xì)胞，加或不加Zl-n-91。孵育20h后收集細(xì)胞，用TRIzol裂解細(xì)胞，按照美國(guó)Invitrog

7、en公司RNA提取的試劑盒提取總的RNA，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作流程將總的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后利用PCR技術(shù)將cDNA中的目的基因擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳可以將擴(kuò)增的目的基因以條帶的方式半定量顯示。 (4)PBMCs加入anti-CD3／anti-CD28共培養(yǎng)，加或不加Zl-n-91。使用流式細(xì)胞術(shù)在單個(gè)細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)Zl-n-91對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ和IL-2及T淋巴細(xì)胞表面活化分子CD25、CD

8、69表達(dá)的影響。 (5)PBMCs用上述方法培養(yǎng)，3天后收集細(xì)胞，按BD PharmingenTM BrdU流式試劑盒說明書的操作流程給不同培養(yǎng)條件的細(xì)胞摻入BrdU，再使用流式細(xì)胞技術(shù)分析Zl-n-91對(duì)BrdU摻入的影響。 (6)按CFSE試劑盒說明書的操作流程標(biāo)記PBMCs，然后按上述方法刺激培養(yǎng)細(xì)胞，3天后收集細(xì)胞，進(jìn)行表面染色，再使用流式細(xì)胞技術(shù)分析Zl-n-91對(duì)細(xì)胞分裂的影響。 結(jié)果 (1)

9、Zl-n-91能夠抑制anti-CD3／anti-CD28誘導(dǎo)的正常人PBMCs IL-17的產(chǎn)生，且這一效應(yīng)呈劑量依賴性。它不是IL-17特異性的抑制劑，除了抑制IL-17，它還抑制IFN-γ的產(chǎn)生。 (2)對(duì)PBMCs，RT-PCR結(jié)果顯示，Zl-n-91同時(shí)能在轉(zhuǎn)錄水平上抑制IL-17的基因轉(zhuǎn)錄。即Zl-n-91對(duì)IL-17抑制作用在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平是一致的。 (3)T細(xì)胞亞群分析的結(jié)果表明，IL-17主要由CD4+

10、T淋巴細(xì)胞表達(dá)，而Zl-n-91能夠抑制CD4+T淋巴細(xì)胞IL-17、IFN-γ和IL-2的表達(dá)。重要的是，Zl-n-91能夠抑制記憶性Th17細(xì)胞亞群IL-17的表達(dá)，而對(duì)IFN-γ,則同時(shí)抑制初始和記憶性T細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)。更重要的是，Zl-n-91在加入的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都有抑制作用，并且在細(xì)胞被活化1h后加入仍然有抑制作用。 (4)Zl-n-91能夠直接作用于CD4+T細(xì)胞，在翻譯水平上，它能抑制anti-CD3／anti

11、-CD28誘導(dǎo)的正常人純化的CD4+T淋巴細(xì)胞IL-17和IFN-γ的產(chǎn)生，并且呈劑量依賴性。在轉(zhuǎn)錄水平上，其作用與翻譯水平上相一致，它能夠抑制IL-17的基因轉(zhuǎn)錄，降低IL-17mRNA的表達(dá)水平。 (5)Zl-n-91能夠抑制anti-CD3／anti-CD28誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞表面CD25和CD69的表達(dá)，并且Zl-n-91能夠抑制CD4+T淋巴細(xì)胞BrdU的摻入并且降低由CFSE標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞的分裂次數(shù)，即Zl-

12、n-91能夠抑制anti-CD3／anti-CD28誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞的活化、增殖和分裂。 結(jié)論 本研究證明了Zl-n-91能夠以劑量依賴方式抑制正常人PBMCs中IL-17和IFN-γ的產(chǎn)生。同時(shí)在基因轉(zhuǎn)錄水平上抑制IL-17mRNA的表達(dá)。流式結(jié)果分析顯示Zl-n-91抑制CD4+T淋巴細(xì)胞IL-17、IFN-γ和IL-2的表達(dá)。Zl-n-91在加入的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都能抑制記憶性Th17細(xì)胞IL-17的表達(dá)，同時(shí)抑制初