Riboswitch cDNA文庫合成及分析.pdf

1、從頭合成(de novo synthesis)技術隨著基因組數(shù)據(jù)庫的日益豐富和DNA自動化合成效率的提高而快速發(fā)展,未來短期內通過合成基因的方法獲得目標序列可能成為普通實驗室的常規(guī)實驗手段,而且合成技術將會逐步取代現(xiàn)有的重組手段。由傳統(tǒng)堿基按序合成的方法來合成各種預期的基因或者基因組序列既浪費時間又浪費資金,且合成的目標序列出錯率極高;目前雖然已開發(fā)芯片技術為大規(guī)模平行合成寡核苷酸提供了一種相對簡單便捷的方法,但是,大多受到合成基因種類

2、或實驗條件等方面的限制而無法推廣成為一種實驗室常規(guī)合成方法。與常規(guī)利用芯片直接寡核苷酸、PCR組裝基因不同,我們對寡核苷酸做了特殊的設計和改良,為寡核苷酸兩端設計了帶有平末端酶切位點的特異引物區(qū),這不僅使得組裝效率大幅度提高,并由常規(guī)的一次合成一種基因增加到同時合成多元基因。從芯片輸出合成寡核苷酸后,經(jīng)過回收和純化,然后混合成為寡核苷酸混合物(OligoMix);在OligoMix擴增及隨后的組裝中,獲得相對保真的組裝材料和較為穩(wěn)定的體

3、外組裝條件,并且以此為基礎,最終完成相關文庫的建立。
　　 我們以核糖開關DNA序列(riboswitch cDNA)為例,分別設計了兩套基因,一套長度小于100nt在芯片上直接合成(SR),一套通過寡核苷酸組裝合成(LR);并以直接測序結果作為依據(jù),將每條測序結果與輸出序列模板進行比對,統(tǒng)計分析堿基出錯率。兩套基因的綜合出錯率分別為2.58‰(SR)、2.37‰(LR),分析堿基出錯可能產(chǎn)生并積累于芯片原位合成及后續(xù)的PCR過

4、程中,但比傳統(tǒng)方法直接合成相應長度的序列出錯率大為降低。再以合成的riboswitch cDNA序列作為模板進行體外轉錄,從而生產(chǎn)出毫克水平的riboswitch RNAs,并用RT-PCR產(chǎn)物驗證還原性良好;通過對多元riboswitch cDNA體外轉錄條件的幾個關鍵因素進行優(yōu)化調整,獲得了優(yōu)化的體外轉錄條件,保證了后續(xù)實驗(如配體結合實驗,藥物等方面開發(fā)實驗)足夠的實驗材料。分析比較Mfold軟件對不同riboswitch序列折疊

5、取得的二級結構及測序結果,歸納出各種核糖開關適配體的關鍵保守序列,為預測發(fā)現(xiàn)新型核糖開關或豐富已發(fā)現(xiàn)核糖開關做了鋪墊。
　　 從芯片產(chǎn)生的OligoMix到合成的完整的多元riboswitch,全部過程包括芯片輸出設計寡核苷酸、PCR擴增富積(LR-OM PCR)、限制性酶切、組裝和組裝后擴增(F-PCR)、克隆、測序驗證以及體外轉錄,全部過程可在一周內完成。這套合成條件經(jīng)過優(yōu)化,原來用于合成預期長度riboswitch的策略,