PPARδ激動(dòng)劑GW501516在oxLDL誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞凋亡及脂質(zhì)蓄積中的作用.pdf

1、研究背景：
　　過氧化物酶體增殖物激活型受體δ(peroxisome Proliferator-activated receptorδ，PPARδ)是過氧化物酶體增殖物激活型受體家族中的一員，廣泛表達(dá)于多種器官和組織，主要控制脂肪組織和肌肉中脂肪酸氧化和能量解偶聯(lián)，抑制巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥，改善動(dòng)脈粥樣硬化，并參與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。PPARδ的配體分為天然配體和合成配體。GW501516是PPARδ的合成配體，屬于苯氧乙酸衍

2、生物，PPARδ與GW501516結(jié)合后，活化的PPARδ與9-順視黃酸類受體(9-cis retinoid X receptor，RXR)形成異二聚體，然后識(shí)別并于靶基因啟動(dòng)子上游的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(peroxisome proliferator response element，PPRE)結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因下游的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及生物學(xué)效應(yīng)。本課題觀察oxLDL對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞PPARδ表達(dá)的影響。同時(shí)以PPARδ激動(dòng)

3、劑GW501516來探討PPARδ對(duì)巨噬細(xì)胞增殖、凋亡的影響及在巨噬細(xì)胞荷脂過程的作用。
　　第一部分，oxLDL對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞PPARδ表達(dá)的影響
　　目的：
　　觀察oxLDL對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞PPARδ表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.用不同濃度（0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L）的oxLDL與THP-1源性巨噬細(xì)胞共孵育24小時(shí)；用RT-PCR及West

4、ern blotting檢測(cè)細(xì)胞 PPARδ mRNA和蛋白的表達(dá)。2.50mg/L oxLDL與THP-1源性巨噬細(xì)胞共孵育0h、12h、24h、48h等不同時(shí)間，用RT-PCR及Western blotting檢測(cè)細(xì)胞PPARδ mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　不同濃度oxLDL可誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞PPARδ的表達(dá)。隨著oxLDL濃度的增加，細(xì)胞PPARδ的mRNA水平及蛋白表達(dá)逐漸增加，差別有顯著性，且

5、在濃度為50mg/L時(shí) PPARδ mRNA的表達(dá)達(dá)峰值（P<0.05）。而時(shí)效試驗(yàn)結(jié)果顯示50mg/L oxLDL與 THP-1源性巨噬細(xì)胞孵育孵育24h時(shí)，PPARδ mRNA水平及蛋白表達(dá)增加明顯，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而在孵育48h后，表達(dá)較24h時(shí)有所減少，但與24h相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　oxLDL可上調(diào)THP-1源性巨噬細(xì)胞PPARδ的表達(dá)
　　第二部分，PPARδ對(duì)THP-

6、1源性巨噬細(xì)胞增殖、凋亡的影響
　　目的：
　　通過PPARδ激動(dòng)劑GW501516活化PPARδ來觀察PPARδ在oxLDL誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞增殖、調(diào)亡中的作用。
　　方法：
　　THP-1單核細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化成為巨噬細(xì)胞后，以50mg/L oxLDL孵育THP-1源性巨噬細(xì)胞24h為陽(yáng)性對(duì)照組，50mg/L oxLDL與不同濃度的PPARδ激動(dòng)劑GW501516（1、10、100nmol及1μmo

7、l）共同孵育THP-1源性巨噬細(xì)胞24h，MTT法檢測(cè)THP-1源性巨噬細(xì)胞增殖活性，Hoechst33258染色、Annexin V/PI雙染后細(xì)胞流式儀檢測(cè)空白組、oxLDL組及1μmol GW501516組細(xì)胞凋亡情況，分光光度法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)caspase3活性變化。
　　結(jié)果：
　　PPARδ激動(dòng)劑GW501516可阻抑oxLDL對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞增殖的抑制作用，且能減少oxLDL誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞的凋亡

8、。MTT及Hoechst33258染色結(jié)果顯示在GW501516濃度達(dá)100nmol時(shí)作用顯著，且1μmol濃度時(shí)作用更明顯（P<0.05）。流式分析結(jié)果也同樣表明1μmol GW501516能顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞的凋亡（P<0.05）。分光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) Caspase3活性顯示 GW501516能呈濃度依賴性下調(diào)caspase3的活性（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　PPARδ激動(dòng)劑GW501

9、516可下調(diào)caspase3活性，抑制oxLDL誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞凋亡。
　　第三部分，PPARδ對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響
　　目的：
　　通過PPARδ激動(dòng)劑GW501516活化PPARδ來觀察PPARδ對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響的影響。
　　方法：
　　THP-1單核細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化成為巨噬細(xì)胞后，以50mg/L oxLDL孵育THP-1源性巨噬細(xì)胞24h為陽(yáng)性對(duì)

10、照組，50mg/L oxLDL與不同濃度的PPARδ激動(dòng)劑GW501516（1、10、100nmol及1μmol）共同孵育THP-1源性巨噬細(xì)胞24h，油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況，高效液相色譜檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、和膽固醇酯含量。
　　結(jié)果：
　　PPARδ激動(dòng)劑GW501516可增加THP-1源性巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，油紅 O染色顯示100nmol GW501516處理后可見細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒體積明顯增大且脂滴數(shù)增多，當(dāng)GW

11、501516濃度達(dá)1μmol時(shí)作用更為明顯(P<0.05)。高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照組總膽固醇含量為483.10±12.70，膽固醇酯/總膽固醇（％）為49.60%。1、10、100nmol和1μmol GW501516處理組總膽固醇含量分別為501.53±15.73，497.69±14.25，647.42±18.62和696.55±20.35；膽固醇酯/總膽固醇（%）分別為56.7%，53.90%，64.48%和66.26%，

12、100nmol和1μmol GW501516組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差別有顯著性（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　PPARδ激動(dòng)劑GW501516可增加THP-1源性巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。
　　總結(jié)：
　　（1）oxLDL可上調(diào)THP-1源性巨噬細(xì)胞PPARδ的表達(dá)。
　?。?）PPARδ激動(dòng)劑GW501516可下調(diào)caspase3活性，抑制oxLDL誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞調(diào)亡。
　　（3）PPARδ