地塞米松和他克莫司對HaCaT細胞糖皮質(zhì)激素受體和熱休克蛋白90表達的調(diào)節(jié).pdf

1、背景:糖皮質(zhì)激素(GC，簡稱激素)外用制劑是治療炎癥性皮膚病的主要藥物，但在治療過程中易出現(xiàn)激素“耐受或抵抗”現(xiàn)象。糖皮質(zhì)激素受體(GR)介導(dǎo)了激素作用的發(fā)揮，GRα的表達水平或與激素的親和力下降將影響患者對激素治療的敏感性，高水平的GR可能預(yù)示對激素的抵抗，而較低水平的GRβ可能預(yù)示對激素的高度敏感或超敏。
　　 熱休克蛋白90(HSP90)是GRα的分子伴侶蛋白，HSP90 水平的改變可能導(dǎo)致其與GR比例失調(diào)并引起對激素反應(yīng)

2、性的減弱。
　　 激素被發(fā)現(xiàn)可下調(diào)GRα或上調(diào)GRβ的表達，可能是引起激素“耐受或抵抗”的原因之一，臨床上為了減少或延緩上述現(xiàn)象的發(fā)生，常采用激素與非激素類抗炎劑交替使用的原則，但這種經(jīng)驗性用藥沒有確切的實驗及理論依據(jù)支持。他克莫司外用制劑在治療炎癥性皮膚病方面具有一定的優(yōu)勢，體外研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司對激素的作用具有一定的調(diào)節(jié)效應(yīng)，他克莫司的作用機制可能涉及GR的活化。
　　 激素可下調(diào)GRα表達或上調(diào)GRβ表達，因此控制

3、外用激素制劑的使用時間很重要。
　　 而在激素停止作用后，激素所致表達水平已經(jīng)發(fā)生改變的GR的后續(xù)變化趨勢尚不清楚；他克莫司與激素制劑的作用機制可能存在潛在的相關(guān)性，它們在單獨作用或與激素配合作用時對GR表達的調(diào)節(jié)也不清楚；皮膚局部炎癥過程涉及復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，他克莫司在皮膚中的抗炎機制值得進一步研究，此外，HSP90作為GR的分子伴侶蛋白，與GRα的作用機制密切相關(guān)，因此有必要了解在調(diào)節(jié)GRα表達的同時對HSP90表達的影響

4、。
　　 目的:研究經(jīng)地塞米松作用及停用后GR表達的后續(xù)變化趨勢；觀察他克莫司對GR表達是否有影響；比較地塞米松和/或他克莫司以不同的組合方式作用時對GR表達的調(diào)節(jié)。
　　 研究他克莫司對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激的HaCaT細胞胞核核因子-κB(NF-κB)表達的調(diào)節(jié)；觀察在上述GRα表達變化的同時HSP90的表達變化。以上研究旨在進一步探討激素“耐受或抵抗”現(xiàn)象的機制及他克莫司的抗炎機制，為他克莫司外用制劑治

5、療炎癥性皮膚病提供理論和實驗依據(jù)，對于臨床上合理地將激素與他克莫司外用制劑聯(lián)合應(yīng)用，從而有效地延緩或改善激素“耐受或抵抗”現(xiàn)象，具有指導(dǎo)意義。
　　 方法:
　　 以人皮膚角質(zhì)形成細胞——HaCaT細胞為研究對象，采用細胞培養(yǎng)、real time-RTPCR、Western blot和免疫熒光-激光共聚焦顯微鏡等技術(shù)，主要進行了以下幾方面的實驗研究：
　　 1.以10-6mol/L地塞米松作用HaCaT細胞48h

6、后，再停用地塞米松，觀察經(jīng)地塞米松作用后24h、48h以及地塞米松停用后24h、48h、72h的GRα和GRβ表達。
　　 2.以10-8mol/L、10-7mol/L或10-6mol/L他克莫司作用HaCaT細胞，觀察12h、24h和36h的GRα和GRβ表達。
　　 3.以10-6mol/L地塞米松和(或)10-6mol/L他克莫司作用HaCaT細胞，分設(shè)5組：對照組(未處理組)、地塞米松作用48h組、他克莫司作用4

7、8h組、地塞米松先作用24h+他克莫司后作用24h組、他克莫司先作用24h+地塞米松后作用24h組，其中后2組分別指以10-6mol/L地塞米松(或他克莫司)作用24h后，再換10-6mol/L他克莫司(或地塞米松)繼續(xù)作用24h。觀察GRα和GRβ的表達。
　　 4.以TNF-α(10ng/ml)單獨或TNF-α(10ng/ml)與他克莫司(10-8mol/l、10-7mol/l、10-6mol/l)同時作用HaCaT細胞，觀

8、察24h和48h胞核NF-κB的表達。
　　 5.觀察1、2、3的處理方式下HSP90的表達變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.以10-6mol/L 地塞米松作用于HaCaT 細胞后的48h 內(nèi)，GRα(mRNA和蛋白質(zhì))表達下調(diào)，GRβ(mRNA和蛋白質(zhì))表達上調(diào)；隨后在地塞米松停用后的72h 內(nèi)，已發(fā)生變化的GRα和GRβ均有不同程度地向原有水平恢復(fù)的趨勢。
　　 2.不同濃度的他克莫司(10-8mol/

9、L、10-7mol/L、10-6mol/L)對HaCaT 細胞GRα和GRβ的表達(包括mRNA和蛋白質(zhì)水平)均沒有明顯的影響。
　　 3.以地塞米松(10-6mol/L)作用HaCaT 細胞48h 后，GRα表達下調(diào)，GRβ表達上調(diào)；以他克莫司(10-6mol/L)作用HaCaT 細胞48h 后，GRα和GRβ表達無明顯變化，以地塞米松(10-6mol/L)和他克莫司(10-6mol/L)按不同的先后順序分別作用HaCaT 細

10、胞24h 后，GRα表達下調(diào)以及GRβ表達上調(diào)的程度均較單獨地塞米松作用48h 時低。
　　 4.他克莫司(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)能以濃度依賴性的方式抑制TNF-α(10ng/mL)刺激的HaCaT 細胞胞核中NF-κB的表達增加。5.10-6mol/L 地塞米松作用于HaCaT 細胞后的48h 內(nèi)，HSP90(mRNA和蛋白質(zhì))表達上調(diào)，隨后在地塞米松停用后的72h 內(nèi)，HSP90 表達有

11、所回落；他克莫司對HSP90的表達無明顯影響；將地塞米松或他克莫司以不同的先后順序依次作用HaCaT 細胞24h 后HSP90 升高的程度低于單獨以地塞米松作用48h 時的相應(yīng)變化。
　　 結(jié)論:
　　 地塞米松下調(diào)角質(zhì)形成細胞中GRα表達并上調(diào)GRβ和HSP90的表達，這可能部分解釋持續(xù)外用激素制劑后出現(xiàn)的激素“耐受或抵抗”現(xiàn)象，地塞米松停用后，上述基因均呈現(xiàn)向其原有水平恢復(fù)的趨勢，可能提示當(dāng)外用激素停用后，由激素引起

12、的皮膚局部對激素敏感性的減弱將有所恢復(fù)，因此臨床上外用激素治療應(yīng)避免長期連續(xù)使用；他克莫司不影響GRα、GRβ和HSP90的表達，并且能以濃度依賴性方式抑制TNF-α刺激的NF-κB 表達增加，提示他克莫司能在皮膚局部發(fā)揮其抗炎作用而又不影響激素的敏感性；地塞米松聯(lián)合他克莫司作用比單獨地塞米松作用時調(diào)節(jié)GRα、GRβ和HSP90表達的程度低，提示臨床上激素與他克莫司配合使用時影響皮膚局部對激素治療敏感性的程度比單獨使用激素時要低，證明激