表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)全身性炎癥反應(yīng)早期多形核白細(xì)胞臟器浸潤(rùn)影響的研究.pdf

1、背景及目的:兒茶素單體表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是綠茶多酚類化合物的一種,具有抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基、抗突變等生物學(xué)活性。以往大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EGCG等一系列兒茶素單體在腫瘤化學(xué)預(yù)防方面的功效,認(rèn)為其參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的細(xì)胞信號(hào)通路中氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子的活性。其中核因子κB(NF-κB)和激活蛋白1(AP-1)為各種炎癥和腫瘤的發(fā)生侵襲過程共同涉及的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。故而兒茶

2、素在腫瘤化學(xué)預(yù)防上的大量研究同時(shí)揭示了該類化合物在抗炎治療方面的巨大潛力。兒茶素類在動(dòng)脈硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥性疾病中已經(jīng)被證明了具有積極的功效,EGCG更被證明為對(duì)炎癥細(xì)胞因子合成影響最顯著的兒茶素單體。但是相對(duì)于慢性炎癥,EGCG對(duì)急性炎癥過程的干預(yù)研究還不多。全身性炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS)是多器官功能不全綜合征(Multiple Organ

3、Dysfunction Syndrome,MODS)的重要病理生理發(fā)展通路。外周血多形核中性白細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophilsw,PMNs)是引起組織損傷,甚至MODS的關(guān)鍵細(xì)胞。PMNs激活、聚集于靶組織和釋放大量破壞性酶類是導(dǎo)致組織損傷和MODS發(fā)生的主要途徑,在此過程中免疫趨化因子和細(xì)胞間粘附分子發(fā)揮了重大作用。局部組織合成的趨化因子,以及PMNs/內(nèi)皮細(xì)胞間的穩(wěn)定粘附過程,對(duì)于PMNs的貼壁、游出

4、、定向移動(dòng)和大量靶器官“扣押”具有不可替代的重要作用。本課題結(jié)合革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型和TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥模型進(jìn)行一系列體內(nèi)體外研究,旨在探討EGCG作為一種高效價(jià)的天然抗氧化劑,在全身性炎癥反應(yīng)早期對(duì)組織巨噬細(xì)胞合成趨化因子的影響,以及對(duì)PMNs/血管內(nèi)皮細(xì)胞間穩(wěn)定粘附的影響;并對(duì)以髓質(zhì)過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活力代表的肺

5、組織PMNs浸潤(rùn)程度作出評(píng)估,從而多方面地論證EGCG對(duì)SIRS早期PMNs遠(yuǎn)隔臟器浸潤(rùn)的影響。實(shí)驗(yàn)方法:1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞的準(zhǔn)備6周齡ICR小鼠,清潔級(jí),EGCG分別以10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg的劑量行腹壁多點(diǎn)皮下注射預(yù)處理,以尾靜脈注射LPS10mg/kg方法造成內(nèi)毒素血癥,復(fù)制全身性炎癥反應(yīng)動(dòng)物模型。根據(jù)研究的需要分別在給予LPS6小時(shí)和18小時(shí)后處死小鼠,留取肺組織標(biāo)本。傳代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human um

6、bilical vein endothelial cells,HUVEC)用含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁生長(zhǎng)至80%板底面積的HUVCE分別換用含EGCG終濃度為10μmol/l、20μmol/l、50μmol/l的新鮮培養(yǎng)基行1小時(shí)預(yù)處理,然后加入TNF-α使終濃度為10ng/ml,復(fù)制出內(nèi)皮細(xì)胞炎癥模型。根據(jù)研究的需要分別在給予TNF-α4小時(shí)和8小時(shí)后消化收集細(xì)胞用于指標(biāo)檢測(cè)

7、。2.RT-PCR法分析小鼠巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2(murine macrophage inflammatoryprotein2,MIP-2)和ICAM-1的基因表達(dá)水平在LPS攻擊6小時(shí)后處死各組小鼠,無菌留取肺組織;消化收集經(jīng)EGCG預(yù)處理和TNF-α誘導(dǎo)4小時(shí)后的HUVEC。TRIZOL法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增,分別以小鼠β-Actin和人GAPDH為內(nèi)參照行半定量分析。3.免疫組化染色及形態(tài)學(xué)觀察在LPS攻擊18小時(shí)后處死

8、各組小鼠,留取肺組織固定,石蠟包埋,切片,以抗小鼠MIP-2多克隆抗體為一抗,辣根過氧化酶標(biāo)記相應(yīng)二抗結(jié)合,DAB顯色,蘇木素復(fù)染鏡檢,拍照。4.Western Blot法分析MIP-2和ICAM-1的蛋白表達(dá)水平在LPS攻擊18小時(shí)后處死各組小鼠,留取肺組織勻漿裂解;消化收集經(jīng)EGCG預(yù)處理和TNF-α誘導(dǎo)8小時(shí)后的HUVEC。提取總蛋白,行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育以相應(yīng)一抗、二抗,ECL發(fā)光液,曝光成像,以β-Actin為內(nèi)

9、參照對(duì)目的條帶的積分吸光度進(jìn)行分析。5.肺組織MPO活力測(cè)定在LPS攻擊18小時(shí)后處死各組小鼠,留取肺組織,準(zhǔn)確稱量并勻漿,利用MPO令供氫體鄰聯(lián)回香胺供氫后生成黃色化合物在460nm處有最大吸收峰的化學(xué)特性,用分光光度法檢測(cè)。按MPO檢測(cè)試劑盒說明操作和換算。6.噻唑蘭(MTT)試驗(yàn)鑒定HUVEC細(xì)胞活力貼壁長(zhǎng)滿75%的96孔板底面積的HUVEC,經(jīng)不同濃度EGCG預(yù)處理和TNF-α誘導(dǎo)8小時(shí)后更換含MTT終濃度5mg/ml的新鮮培養(yǎng)

10、基繼續(xù)孵育4小時(shí),吸棄上清加入二甲基亞砜(DMSO),繼續(xù)孵育半小時(shí),酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。7.HUVEC跟PMNs的粘附實(shí)驗(yàn)取健康成年人外周血10ml,用中性粒細(xì)胞分離液(聚蔗糖—泛影葡胺分層液)以密度梯度離心法得到較純的PMNs。臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)活力,血清培養(yǎng)基重懸PMNs。貼壁生長(zhǎng)在24孔板底的HUVEC經(jīng)EGCG預(yù)處理和TNF-α誘導(dǎo)8小時(shí)后加入等量PMNs,再共孵育1小時(shí),結(jié)束后輕洗去未粘附的PMNs,收集洗脫液,對(duì)

11、孵育前和洗脫液中的PMNs進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算出粘附率。8.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)字結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間結(jié)果比較采用單因素方差分析,P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理使用SPSS10.0版完成。結(jié)果:1.EGCG使內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺部MIP-2的mRNA表達(dá)和蛋白合成呈劑量依賴性下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.免疫組化和組織病理發(fā)現(xiàn)EGCG使內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺部MIP-2蛋白表達(dá)減少,并且使

12、肺間質(zhì)腫脹和白細(xì)胞浸潤(rùn)情況減輕。3.EGCG使內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺部MPO活力呈劑量依賴性下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4.50μmol/l的EGCG濃度導(dǎo)致了TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC和正常生長(zhǎng)的HUVEC的凋亡增加(P<0.05),而10μmol/l、20μmol/l兩個(gè)濃度的EGCG不引起HUVEC的活力改變(P>0.05)。5.EGCG使TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC的ICAM-1的mRNA表達(dá)和蛋白合成呈劑量依

13、賴性下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。6.EGCG使TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC跟PMNs間的粘附率呈劑量依賴性下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:本研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EGCG抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)的小鼠肺部趨化因子的合成以及減少肺組織PMNs的浸潤(rùn)程度,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EGCG抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC膜表面重要粘附分子的合成以及抑制HUVEC和PMNs間的粘附,并發(fā)現(xiàn)這些效應(yīng)呈現(xiàn)一定的濃度和劑量依賴性。故