Oct4聯(lián)合小分子化合物誘導肝細胞重編程為胰腺干祖樣細胞.pdf

1、目的:
　　1、探討在Oct4介導下小鼠原代肝細胞發(fā)生去分化的細胞形態(tài)及基因表達的變化趨勢,探索肝細胞去分化后向胰腺干祖樣細胞誘導的合適時機。
　　2、應用小分子化合物將去分化的肝細胞誘導為胰腺干祖樣細胞。
　　方法:
　　第一部分:分離培養(yǎng)小鼠原代肝細胞,構(gòu)建慢病毒表達質(zhì)粒pWPT-Oct4,包裝表達Oct4的慢病毒,將其感染原代肝細胞,觀察細胞的形態(tài)變化,用RT-PCR法監(jiān)測nestin、ALB、AFP以及F

2、oxa2的表達并進行半定量分析。用RT-PCR法監(jiān)測“中間狀態(tài)細胞”標志物:SOX17,HNF6,HNF1β,SOX9的表達趨勢,結(jié)合細胞形態(tài)的變化,探索肝細胞去分化后向胰腺干祖樣細胞誘導的合適時機。
　　第二部分:根據(jù)SOX9的表達,聯(lián)合應用小分子化合物:表皮生長因子(EGF),堿性成纖維細胞生長因子(bFGF),Exendin-4等對去分化后的肝細胞進行誘導,觀察細胞形態(tài),用RT-PCR及免疫熒光染色法檢測胰腺干細胞標志物CK

3、19、ABCG2的表達。
　　結(jié)果:
　　第一部分:感染Oct4-慢病毒后,原代肝細胞胞內(nèi)顆粒逐漸釋放出來,在第7天時細胞的增殖能力有所增強。RT-PCR結(jié)果顯示,感染Oct4-慢病毒后,成熟肝細胞的標志物ALB表達減弱,不成熟肝細胞標志物AFP、Foxa2表達增強,表明肝細胞發(fā)生去分化,細胞成熟表型逐漸丟失。在此過程中,多譜系前體細胞標志物nestin表達逐漸增強,從第3天持續(xù)至第9天,從第12天起開始減弱。在感染Oct4

4、-慢病毒后第2天可檢測到HNF1β,HNF6的表達,第6天可檢測到SOX9的表達。
　　第二部分:在SOX9開始表達的第6天起,用小分子化合物誘導去分化的肝細胞生成胰腺干祖樣細胞,在誘導4天后細胞呈集落樣生長,可檢測到胰腺干細胞標志物CK19、ABCG2的表達。
　　結(jié)論:
　　在基因Oct4及小分子化合物聯(lián)合誘導下,肝細胞經(jīng)去分化可進一步向胰腺譜系誘導。本實驗探索了體外產(chǎn)生胰腺干細胞的新途徑,為擴大胰島移植的來源和實