小鼠胚胎成纖維細(xì)胞重編程過(guò)程中p53、MDM2、Aurka基因相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究攜帶有轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）的腺病毒感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFc)，通過(guò)誘導(dǎo)出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞
　?。╥PSC），并分析在重編程過(guò)程中p53基因、MDM2基因、Aurka基因的變化規(guī)律，為提高誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)效率提供思路。
　　方法：1.對(duì)前期凍存的MEFc進(jìn)行復(fù)蘇，待MEFc生長(zhǎng)良好后，加入帶有4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（OSCK）的腺病毒，反復(fù)感染兩次后，觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；2.對(duì)誘導(dǎo)出的

2、細(xì)胞進(jìn)行多能性鑒定：通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、成瘤性、堿性磷酸酶(偶氮偶聯(lián)法)染色，及干細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)；3.將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別按照誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后24h、誘導(dǎo)后1w、誘導(dǎo)后2w四個(gè)時(shí)間段，利用Real-Time PCR技術(shù)，多次測(cè)量p53基因、MDM2基因、Aurka基因的轉(zhuǎn)錄情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各個(gè)基因內(nèi)各個(gè)時(shí)間的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。
　　結(jié)果：1.對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行多

3、能性鑒定：a、形態(tài)學(xué)變化：可觀察到細(xì)胞邊界輪廓清楚，胞體較小鼠成纖維細(xì)胞變大，變圓，長(zhǎng)度變短，少數(shù)呈多變性，仍有明顯突起，但突起長(zhǎng)度變短。b、成瘤性觀察：約7-8周后可見到大鼠根部明顯2-3個(gè)畸胎瘤，用手觸及包塊質(zhì)中等硬度，可滑動(dòng)，與周圍組織無(wú)粘連，表面光滑。取出包塊組織，可見到包塊淡紅色塊橢圓形柱狀物，大小為約1cm×0.5cm×0.3cm。將取下的組織行切片、HE染色處理，可見細(xì)胞核成藍(lán)色，胞質(zhì)成粉紅色，在中可見到大量杯狀細(xì)胞組成的

4、腺體組織、血管、大量的脂肪組織。c、堿性磷酸酶鑒定：可見大量堿性磷酸酶陽(yáng)性顆粒。d、干細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)：Oct4、Sox2及Nanog在誘導(dǎo)的細(xì)胞中均有表達(dá)。2.在誘導(dǎo)過(guò)程中p53轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律：1、轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后1w、轉(zhuǎn)染后2w比較，相對(duì)表達(dá)量差異顯著（P<0.05）。2、轉(zhuǎn)染后24h與轉(zhuǎn)染后1w及轉(zhuǎn)染后兩周比較，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3.轉(zhuǎn)染后1w與轉(zhuǎn)染后兩周比較，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

5、5)。p53的轉(zhuǎn)錄在四因子腺病毒轉(zhuǎn)染后24h既出現(xiàn)升高，在轉(zhuǎn)染1w后較高，而在轉(zhuǎn)染2w后出現(xiàn)下降。在誘導(dǎo)過(guò)程中MDM2轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律:1、轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后1w、轉(zhuǎn)染后2w比較，RQ差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2、轉(zhuǎn)染后24h與轉(zhuǎn)染后1w及轉(zhuǎn)染后兩周比較，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3、轉(zhuǎn)染后1w與轉(zhuǎn)染后兩周比較，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MDM2的轉(zhuǎn)錄在四因子腺病毒轉(zhuǎn)染后24h出現(xiàn)下

6、降，1w時(shí)下降明顯，而在轉(zhuǎn)染2w后卻出現(xiàn)升高。與p53基因的變化規(guī)律成反比。在誘導(dǎo)過(guò)程中AURKA轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律:1、轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后1w，RQ差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與轉(zhuǎn)染后2w比較， RQ差異不顯著（P>0.05）。2、轉(zhuǎn)染后24h與轉(zhuǎn)染后1w及轉(zhuǎn)染后2w比較，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3、轉(zhuǎn)染后1w與轉(zhuǎn)染后2w比較，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？烧J(rèn)為Aurka的轉(zhuǎn)錄在四因子

7、腺病毒轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)明顯升高，1w時(shí)較轉(zhuǎn)染后仍高，而在轉(zhuǎn)染2w呈現(xiàn)與正常水平,且Aurka的轉(zhuǎn)錄升高水平明顯高于p53基因。通過(guò)利用MDM2與Aurka的抑制劑發(fā)現(xiàn)細(xì)胞p53蛋白表達(dá)均明顯升高。
　　結(jié)論1.細(xì)胞的重編程過(guò)程能夠激活p53信號(hào)通路，p53轉(zhuǎn)錄在轉(zhuǎn)染2w后出現(xiàn)下降，考慮重編程已經(jīng)完成，可考慮干預(yù)重編程過(guò)程的時(shí)間在2w內(nèi)。2.細(xì)胞重編程過(guò)程中MDM2水平下降，通過(guò)利用MDM2拮抗劑在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達(dá)明顯增