慢性HBV感染進程中Tim-3分子對CD8+T細胞及單核細胞功能的不同調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　慢性乙型肝炎病毒感染(chronic hepatitis B virus infection)是威脅全球的重大公共健康問題。慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)及慢性乙型肝炎肝硬化(hepatitis B virus related-cirrohosis，HBV-related cirrhosis)是慢性乙型肝炎病毒感染進展的先后兩個病理階段。CHB患者主要表現(xiàn)為病毒特異性的適

2、應性免疫功能失活，而嚴重的慢性乙型肝炎肝硬化患者則進一步會出現(xiàn)固有免疫功能的紊亂。目前，在HBV感染自然史的不同階段，調(diào)控適應性及固有免疫功能變化的分子機制尚不明確。T細胞免疫球蛋白及粘蛋白分子-3(T cell Immunoglobulindomain and Mucindomain protein-3，Tim-3)是近年來發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)控分子，既表達于適應性免疫細胞如CD4+及CD8+T細胞，也表達于固有免疫細胞如單核細胞，樹突狀細胞

3、，肥大細胞等，因此Tim-3具有廣泛的免疫調(diào)控功能。本課題旨在研究在慢性乙型病毒性肝炎及慢性乙型肝炎肝硬化階段CD8+T細胞及單核細胞功能的分別改變，及Tim-3在慢性乙型病毒性肝炎及慢性乙型肝炎肝硬化階段分別對CD8+T細胞及單核細胞功能的調(diào)控作用，從而進一步理解慢性HBV感染進展的免疫學特點并為尋求新的治療方法提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.Tim-3調(diào)控CD8+T細胞功能收取125例CHB患者及招募的54例健康

4、志愿者外周血并使用流式細胞術檢測總CD8+T細胞表面Tim-3表達。同時分選CD8+T細胞，使用五聚體技術檢測HBV特異性CD8+T細胞表面的Tim-3表達。流式細胞術比較Tim-3+/-CD8+T細胞的表型及細胞因子分泌功能。分離患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclearcell，PBMC)，分別予HBV抗原肽段、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(phorbol12-myristate13-aceta

5、te, PMA)/離子霉素(ionomycin)及抗人CD3抗體刺激及Tim-3通路阻斷后，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液細胞因子分泌，流式細胞術檢測胞內(nèi)干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)分泌，羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyflu-oresceindiacetate succinimidyl ester, CFSE)法檢測CD8+T細胞增殖。
　　2.Tim-3調(diào)控單核細胞功能
　　收取79例慢性乙型肝炎

6、肝硬化患者及31例招募的例健康志愿者外周血并使用流式細胞術檢測總CD14+單核細胞表面Tim-3表達。同時使用顯色基質(zhì)法檢測患者及健康志愿者血漿內(nèi)毒素。同時分選CD14+單核細胞，體外使用內(nèi)毒素刺激單核細胞并檢測Tim-3的動態(tài)變化。同時比較Tim-3+/-CD14+單核細胞的表型。分離患者及健康志愿者PBMC或分選CD14+單核細胞，予內(nèi)毒素刺激及/或Tim-3通路阻斷后，流式細胞術比較患者與健康人的單核細胞的吞噬功能、細胞因子分泌及

7、HLA-DR表達，ELISA法檢測上清誘導型一氧化氮合酶分泌。
　　研究結(jié)果：
　　1.Tim-3調(diào)控CD8 T細胞功能
　　(1)慢乙肝患者CD8+T細胞表面Tim-3表達較健康對照升高，且Tim-3表達水平與ALT呈正相關。抗病毒治療后CD8+T細胞的Tim-3表達水平明顯下降。
　　(2)慢乙肝患者HBV特異性CD8+T細胞表面Tim-3表達水平高于CMV特異性CD8+T細胞Tim-3表達。
　　(3

8、) Tim-3+CD8+T細胞中終分化效應記憶性細胞(terminally differentiation effectormemory, TDEM)的比例高于Tim-3-CD8+T細胞，而初始性細胞的比例低于Tim-3-CD8+T細胞。
　　(4) Tim-3+CD8+T細胞的CD127表達低于Tim-3-CD8+T細胞，而CD57表達高于Tim-3 CD8+T細胞。Tim-3+CD8+T細胞在抗原刺激后分泌IFN-γ的水平低于

9、Tim-3-CD8+T細胞。
　　(5)阻斷Tim-3通路后能夠顯著恢復病毒特異性CD8+T細胞的細胞因子分泌及增殖能力，但不能提高對非特異抗原刺激的應答能力。
　　3.Tim-3調(diào)控單核細胞功能
　　(1)嚴重的慢性乙型肝炎肝硬化失代償患者CD14+單核細胞表面Tim-3表達較正常人明顯下降。
　　(2) CD14+單核細胞Tim-3表達下降與患者內(nèi)毒素血癥有關。體外LPS刺激能夠誘導單核細胞Tim-3表達下降

10、。
　　(3) Tim-3+CD14+單核細胞表達CD1a及CD83較Tim-3-細胞高，但CD80及CD86表達較低。
　　(4)嚴重的慢性乙型肝炎肝硬化失代償患者單核細胞吞噬功能較正常人為低，HLA-DR表達水平降低，而iNOS分泌能力則升高，分泌促炎細胞因子TNF-α，IL-1β和抑炎細胞因子IL-10水平均升高。
　　(5)阻斷Tim-3通路可下調(diào)單核細胞吞噬功能，降低iNOS分泌水平，抑制TNF-α分泌水平而