副雞禽桿菌外膜蛋白gcbG的原核表達及莢膜轉(zhuǎn)運基因HctC缺失株的構(gòu)建.pdf

1、雞鼻炎是由副雞禽桿菌引起的以雞腫頭腫臉為主要癥狀的急性呼吸道傳染病,主要引起育成雞生長發(fā)育受阻和淘汰率增加,且造成蛋雞產(chǎn)蛋量明顯下降,給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。因此,進行Apg新型疫苗的研發(fā),研制出對雞安全、有效并能迅速產(chǎn)生免疫力的基因工程疫苗為當前研究的主要任務(wù)。
　　本研究對 B型標準株 gcbG基因進行了克隆、測序,大小為495bp,將其插入pGEX-5X-1原核表達質(zhì)粒中,構(gòu)建pGEX-5X-gcbG原核表達載體,轉(zhuǎn)化大

2、腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,獲得gcbG蛋白原核表達菌株;對gcbG蛋白進行表達、最佳表達條件的優(yōu)化以及表達產(chǎn)物的免疫原性分析,結(jié)果表明,本實驗成功地在體外表達了APg血清B型gcbG蛋白,大小約為44ku,該蛋白在IPTG濃度為1 mM/L,溫度為28℃,表達時間為5h,表達量最高,且為包涵體表達。純化gcbG重組蛋白包涵體,進行Western blotting檢測,結(jié)果表明,目的蛋白與Apg雞陽性血清有特異性免疫反應(yīng)。

3、>　　對B型標準株HctC基因進行了克隆、測序,大小為1164 bp,以副雞禽桿菌標準株0221為實驗基礎(chǔ),利用轉(zhuǎn)座子采用定點克隆的方法,擴增其全長片段,將其連入pGEM-T載體,通過反向 PCR并反向自連后獲得基因缺失片段,將基因缺失片段轉(zhuǎn)入 pemoC2自殺質(zhì)粒構(gòu)建基因缺失轉(zhuǎn)移載體。在成功構(gòu)建基因缺失轉(zhuǎn)移載體的基礎(chǔ)上,將其電轉(zhuǎn)入副雞禽桿菌感受態(tài)細胞中,通過自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法得到副雞禽桿菌HctC基因缺失株。結(jié)果表明,Apg基