TLR4在大鼠腦梗死組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及OMT抗炎機(jī)制的研究.pdf

1、目的：腦梗死后繼發(fā)性腦損傷的病理生理機(jī)制復(fù)雜，其中過度炎癥免疫反應(yīng)存在于腦梗死后壞死及缺血區(qū)域，導(dǎo)致炎癥損傷，此己成共識(shí)，因此減輕炎癥損傷成為治療急性腦梗死的主要途徑之一。然而，在臨床試驗(yàn)中抗炎治療并沒有取得預(yù)期的效果，或許這些藥物抑制炎癥通路的效果有限。Toll樣受體(Toll-1ike receptors,TLRs)的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了人們對(duì)炎癥機(jī)制的理解，其中TLR4的結(jié)構(gòu)及其參與促炎反應(yīng)、促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟分化及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等方面研究的較

2、為清楚。近年來，TLR4在非病原微生物性炎癥損傷中的作用逐漸引起了人們的關(guān)注，發(fā)現(xiàn)其在腦梗死等非病原微生物性炎癥損傷過程中具有重要的作用。 氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)是從豆科槐屬植物苦參(Sophora flavescens Ait)中提取的生物堿，具有四環(huán)的喹嗪啶類結(jié)構(gòu)。OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理作用，近幾年對(duì)于OMT的研究很多，多集中在抗肝炎及抗腫瘤等方面，但關(guān)于氧化苦參堿對(duì)腦血管

3、疾病的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)觀察了不同劑量OMT對(duì)腦梗死大鼠腦組織TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)的影響，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察OMT對(duì)腦梗死大鼠腦組織TLR4蛋白表達(dá)的影響，旨在從TLR4基因、蛋白水平探討OMT抗炎作用機(jī)制。 方法：80只健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，隨機(jī)分成4組：假手術(shù)組，生理鹽水治療組，大劑量OMT治療組(120 mg/kg)，小劑量OMT治療組(80 mg/kg)，每組根據(jù)不同

4、的時(shí)間點(diǎn)又分為6 h、12 h、24 h、48 h四個(gè)亞組，每亞組均為5只大鼠。按照改良的線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將OMT以蒸餾水制成相同濃度混懸液(40 mg/ml)，大劑量OMT治療組給予OMT 120 mg/kg，小劑量OMT治療組給予OMT 80 mg/kg，生理鹽水治療組均給予1 ml生理鹽水，各組均為腹腔注射給藥，手術(shù)完畢后即刻給藥一次，之后每天一次，直至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭處死動(dòng)物。假手術(shù)組，除不插線栓外其余操作同生理

5、鹽水治療組。各實(shí)驗(yàn)組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭處死動(dòng)物，無菌操作下取前囟前2 mm至前囟后3 mm腦組織，以前囟后0.5 mm為界分為前后兩部分，前部分取梗死灶周圍腦組織，快速稱取100 mg，置凍存管中放入液氮保存待用，用于抽提總RaNA，RT-PCR技術(shù)觀察不同劑量OMT對(duì)腦梗死大鼠腦組織TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)的影響。后部分腦組織用4％多聚甲醛固定液固定24 h以上，但不能超過7 d，石蠟包埋，冠狀切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(Hemotoxy

6、lin-esion,HE)染色觀察大鼠腦組織的病理改變，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)不同劑量OMT對(duì)腦梗死大鼠腦組織TlR4動(dòng)態(tài)表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1.腦組織切片HE染色觀察：假手術(shù)組無梗死灶，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、形態(tài)正常，無間質(zhì)水腫。生理鹽水治療組、OMT小劑量治療組可見缺血中心區(qū)組織疏松，形似海綿；神經(jīng)元胞體縮小，變形、核固縮；間質(zhì)水腫明顯；隨時(shí)間延長多形核白細(xì)胞(Polymorphonuclear leukocyte，PMN)浸潤

7、增多，其中PMN浸潤在48 h最明顯，OMT大劑量治療組與生理鹽水治療組比較PMN浸潤明顯減輕。 2 各實(shí)驗(yàn)組腦組織TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)：各實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)TLR4 mRNA/β-actin mRNA灰度比值表明：各實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)TLR4 mRNA均有表達(dá)。假手術(shù)組與生理鹽水治療組、OMT小劑量治療組及OMT大劑量治療組比較，假手術(shù)6 h組為0.48±0.27，生理鹽水6 h組為0.73±0.07，OMT小劑量6 h組為0.65±0

8、.02，OMT大劑量6 h組為0.51±0.04，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中生理鹽水6 h組與OMT小劑量6h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，假手術(shù)6 h組與OMT大劑量6 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)12 h組為0.50±0.01，生理鹽水12 h組為0.91±0.07，OMT小劑量12 h組為0.81±0.09，OMT大劑量12 h組為0.68±0.10，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中生理鹽水12 h組與

9、OMT小劑量12 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)24 h組為0.50±0.00，生理鹽水24 h組為1.09±0.10，OMT小劑量24 h組為0.99±0.11，OMT大劑量24 h組為0.77±0.01，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中生理鹽水24 h組與OMT小劑量24 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)48 h組為0.49±0.03，生理鹽水48 h組為1.14±0.18，OMT小劑量48 h組為1.01

10、±0.04，OMT大劑量48 h組為0.82±0.05，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中生理鹽水48 h組與OMT小劑量48 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.各實(shí)驗(yàn)組腦組織TLR4的動(dòng)態(tài)表達(dá)：假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)僅有少量TLR4表達(dá)；TLR4表達(dá)以小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)兀細(xì)胞為主，位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，室管膜和腦室脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞有弱陽性表達(dá)。假手術(shù)組與生理鹽水治療組、OMT小劑量治療組、OMT大劑量治療組比較，(以下數(shù)值單位均為“個(gè)

11、”)假手術(shù)6 h組為0.48±0.18，生理鹽水6 h組為1.64±0.24，OMT小劑量6 h組為1.14±0.21，OMT大劑量6 h組為0.63±0.07，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中生理鹽水6 h組與OMT小劑量6 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，假手術(shù)6 h組與OMT大劑量6 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)12 h組為0.38±0.18，生理鹽水12 h組為6.10±0.29，OMT小劑量12 h組為5

12、.21±0.49，OMT大劑量12 h組為3.36±0.55，p＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中生理鹽水12 h組與OMT小劑量12 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)24h組為0.44±0.17，生理鹽水24 h組為10.42±0.79，OMT小劑量24 h組為8.91±0.32，OMT大劑量24 h組為6.33±0.63，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中生理鹽水24 h組與OMT小劑量24 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

13、義；假手術(shù)48 h組為0.40±0.25，生理鹽水48 h組為10.67±0.99，OMT小劑量48 h組為9.32±0.70，OMT大劑量48 h組為6.54±0.89，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中生理鹽水48 h組與OMT小劑量48 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：局灶性腦梗死后損傷組織釋放的內(nèi)源性激活物被TLR4識(shí)別，啟動(dòng)了TLR4的信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)一步激活并釋放致炎細(xì)胞因子而造成組織損傷。而氧化苦參堿可以降低TL