和血生絡法對實驗性心肌梗死大鼠的促血管新生作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　 冠心病是中老年人的常見病和多發(fā)病，隨著飲食結構等因素的變化，發(fā)病年齡日益年輕化，發(fā)病人數(shù)迅速上升，已成為引起死亡人數(shù)最多的十種疾病之一?，F(xiàn)代醫(yī)學雖然對此病有藥物、手術、介入等多種療法，但仍有很多患者不適用于上述療法或效果不佳，治療性血管新生療法的產(chǎn)生為這些患者帶來了希望。已有數(shù)千年歷史的中醫(yī)藥雖然是這一新療法的踐行者，取得了很好的臨床療效，但由于理論認識的差異性，導致中醫(yī)藥療法不能被廣泛接受。我們依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論認

2、識，并結合文獻及臨床研究，提出血脈不和是冠心病的基本病機，以調和血脈為內涵的和血生絡法是本病的基本治法。通過建立實驗性心肌梗死模型，觀察和血生絡法對心梗模型血管新生的影響，利用逆轉錄-聚合酶鏈反應、蛋白質印跡等現(xiàn)代先進的檢測技術觀察了bFGF、MMP-2/TIMP-2、G-CSF、AKT、ERK等指標的變化，從生長因子、細胞外基質、內皮祖細胞、信號通路等多方面對促血管新生的機制進行了探討，為和血生絡法廣泛應用于臨床奠定了堅實的理論基礎。

3、
　　 第一部分
　　 中醫(yī)對冠心病和血管新生的認識及和血生絡法的提出
　　 簡述了冠心病的概念、表現(xiàn)、分類、治療原則及常規(guī)治療方法。鑒于冠心病治療中存在的不足，介紹了本病治療中的新思路，即治療性血管新生。對其主要研究概況及應用前景進行了簡要歸納。由于治療性血管新生目前僅限于理論研究和臨床前期階段，并不能實際應用于臨床，而中醫(yī)的“脈絡”與現(xiàn)代醫(yī)學的“血管”對應，血管新生與中醫(yī)學“生脈”等理論具有高度一致性，這就為

4、重新審視中醫(yī)藥的治療機制提供了新思路，也為中醫(yī)藥在冠心病的治療中發(fā)揮其良好的作用提供了廣闊前景。
　　 整理查閱了大量的古今中醫(yī)藥與冠心病相關的文獻，對與冠心病相關的中醫(yī)病名、臨床表現(xiàn)及鑒別進行了整理歸納，同時分析了古今對冠心病病因病機及治療方法的認識，結合我們的臨床體會提出了冠心病的基本病機是血脈失和，而“和血生絡法”是冠心病的基本治法。
　　 第二部分
　　 心肌梗死大鼠模型制備及“和血生絡法”促血管新生的作

5、用
　　 方法：
　　 健康雄性Wistar大鼠通過結扎冠狀動脈左前降支建立實驗性心肌梗死動物模型。選取造模成功大鼠48只，按照隨機數(shù)字表法隨機分為模型組(M)、消心痛組(Y)、和血生絡低劑量組(D)、和血生絡高劑量組(G)，每組12只；另設假手術組(J)大鼠12只。術后24h灌胃給藥，藥物干預3周后，每組取6只大鼠心臟以TTC染色法測定大鼠左室心肌梗死范圍；每組取另6只大鼠心臟免疫組化方法檢測心肌梗死邊緣區(qū)CD34表達

6、，檢測微血管數(shù)量和微血管密度。同時應用HE染色觀察梗死邊緣區(qū)的病理變化。
　　 結果：
　　 1 大鼠一般狀況的觀察比較
　　 大鼠呈蜷縮狀態(tài)，精神萎靡，活動較少，毛發(fā)黃白色枯槁無光澤且多倒豎，進食量明顯減少。抓握大鼠時無反抗或反抗較輕。假手術組大鼠手術后1天，食欲和運動量即恢復至術前狀態(tài)，毛發(fā)平滑光澤無枯槁現(xiàn)象。實驗進程中，模型組大鼠仍然表現(xiàn)出飲食、活動少的狀態(tài)，因而出現(xiàn)增重緩慢，甚至無增重的情況。皮毛狀態(tài)未見

7、明顯改觀。各用藥物組大鼠精神狀態(tài)逐漸好轉，表現(xiàn)出不同程度增重，尤以和血生絡大劑量組最為明顯。
　　 2 心肌梗死范圍
　　 假手術組大鼠未出現(xiàn)心肌梗死。模型組大鼠心肌梗死范圍為(29.6±1.4)％，和血生絡高劑量組、低劑量組及消心痛組大鼠心肌梗死范圍分別為（19.5±2.2）％、（22.0±2.3）％、(26.1±2.5)％。各治療組梗死范圍均明顯小于模型組(P＜0.05)，和血生絡高劑量組、和血生絡低劑量組明顯優(yōu)于消

8、心痛組(P＜0.05)，差別具有統(tǒng)計學意義。
　　 3 心肌梗死邊緣區(qū)微血管數(shù)量(MVC)和微血管密度(MVD)
　　 假手術組大鼠MVC/MVD為75.50±4.29，模型組大鼠為88.50±2.44，較假手術組大鼠顯著增高(P＜0.05)。和血生絡高劑量組、低劑量組及消心痛組大鼠MVC/MVD分別為133.90±6.50、122.03±2.68、117.50±3.68。各治療組明顯高于模型組(P＜0.05)。和血生絡

9、高劑量組明顯優(yōu)于和血生絡低劑量組及消心痛組（P＜0.05）。
　　 4 病理組織變化
　　 模型組高倍鏡下部分心肌細胞腫脹，間質水腫，梗死灶可見心肌纖維溶解，纖維組織增生、炎細胞浸潤。和血生絡低劑量組、消心痛組表現(xiàn)為心肌細胞壞死較模型組少見，少量炎細胞浸潤，纖維組織增生少見。和血生絡高劑量組大多數(shù)心肌細胞無異常，個別心肌壞死、炎細胞浸潤，無明顯纖維增生。假手術組心肌細胞未見明顯異常，無纖維組織增生及炎細胞浸潤。
　

10、　 第三部分
　　 “和血生絡法”對堿性成纖維細胞生長因子的影響
　　 方法：
　　 健康雄性Wistar大鼠通過結扎冠狀動脈左前降支建立實驗性心肌梗死動物模型。選取造模成功大鼠48只，按照隨機數(shù)字表法隨機分為模型組(M)、消心痛組(Y)、和血生絡低劑量組(D)、和血生絡高劑量組(G)，每組12只；另設假手術組(J)大鼠12只。術后24h灌胃給藥，藥物干預3周后，每組取6只大鼠心臟免疫組化法檢測bFGF在大鼠心

11、梗邊緣區(qū)中的蛋白表達，用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)分析其平均灰度。每組取6只大鼠心臟組織RT-PCR法檢測bFGFmRNA在大鼠左室心肌組織的表達，用法國VL公司BIO-PROFIF凝膠圖象分析系統(tǒng)對目的電泳條帶進行分析，以相應的內參電泳條帶作為參照，結果以兩者之積分吸光度的比值表示。每組取8只大鼠的血清ELISA法檢測bFGF在血清中的含量。
　　 結果：
　　 1 大鼠心梗邊緣區(qū)bFGF的蛋白表

12、達及其平均灰度
　　 模型組、假手術組平均灰度分別為197.83±5.55、218.20±3.55，模型組bFGF蛋白表達明顯高于假手術組(P＜0.05)。和血生絡高劑量組、和血生絡低劑量組、消心痛組平均灰度分別為163.02±6.56、174.93土2.66、176.80±3.59，bFGF蛋白表達較模型組明顯增高(P＜0.05)。和血生絡高劑量組較和血生絡低劑量組與消心痛組表達明顯增強（P＜0.05）。
　　 2 b

13、FGFmRNA在大鼠左室心肌組織的表達及積分吸光度的比值
　　 模型組（0.31±0.01）較假手術組（0.18±0.05）明顯增強(P＜0.05)。和血生絡高劑量組（0.69±0.17）、和血生絡低劑量組（0.49±0.04）、消心痛組(0.70±0.10)bFGFmRNA表達較模型組明顯增強(P＜0.05)。和血生絡高劑量組與消心痛組較和血生絡低劑量組表達明顯增強（P＜0.05）。
　　 3 bFGF在血清中的含量<

14、br>　　 模型組（3.78±0.25）血清中bFGF含量較假手術組（2.99±0.42）增高，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。和血生絡低劑量組（4.32±1.29）亦較模型組增高但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。和血生絡高劑量組（5.29±1.13）、消心痛組（5.04±2.10）較模型組bFGF含量明顯增高(P＜0.05)。
　　 第四部分
　　 “和血生絡法”對基質金屬蛋白酶-2及基質金屬蛋白酶組織抑制劑-2的影響

15、
　　 方法：
　　 健康雄性Wistar大鼠通過結扎冠狀動脈左前降支建立實驗性心肌梗死動物模型。選取造模成功大鼠48只，按照隨機數(shù)字表法隨機分為模型組(M)、消心痛組(Y)、和血生絡低劑量組(D)、和血生絡高劑量組(G)，每組12只；另設假手術組(J)大鼠12只。術后24h灌胃給藥，藥物干預3周后，每組取6只大鼠心臟免疫組化法檢測MMP-2及TIMP-2在大鼠心梗邊緣區(qū)中的蛋白表達，用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)

16、學圖文分析系統(tǒng)分析其平均光密度值。并與bFGF作相關性分析。
　　 結果：
　　 1 MMP-2在大鼠心梗邊緣區(qū)中的蛋白表達
　　 模型組(0.1490±0.0119)MMP-2蛋白表達較假手術組(0.0688±0.0072)明顯增高(P＜0.05)。和血生絡高劑量組（0.2545±0.0161）、和血生絡低劑量組（0.2174±0.0116）、消心痛組（0.2204±0.0109）MMP-2蛋白表達較模型組明顯

17、增高(P＜0.05)。和血生絡高劑量組強于消心痛組及和血生絡低劑量組（P＜0.05）。
　　 2 TIMP-2在大鼠心梗邊緣區(qū)中的蛋白表達
　　 模型組(0.1328±0.0104)TIMP-2蛋白表達較假手術組（0.0835±0.0085）明顯增高（P＜0.05）。和血生絡高劑量組（0.1878±0.0106）、消心痛組（0.1812±0.0105）較模型組TIMP-2蛋白表明顯增高（P＜0.05）。和血生絡低劑量組（

18、0.1690±0.0093）雖從數(shù)值看高于模型組，但并無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　 3 MMP-2與TIMP-2比值變化
　　 模型組（1.12±0.05）MMP-2/TIMP-2較假手術組明（0.82±0.03）顯增高(P＜0.05)。和血生絡高劑量組（1.36±0.04）、和血生絡低劑量組（1.29±0.04）、消心痛組（1.22±0.04）MMP-2/TIMP-2較模型組明顯增高(P＜0.05)。中藥組強于

19、消心痛組且和血生絡高劑量組強于和血生絡低劑量組(P＜0.05)。
　　 4 bFGF與MMP-2、MMP-2/TIMP-2的相關性分析
　　 將實驗二心肌bFGF蛋白表達與MMP-2、MMP/TIMP的表達進行相關性分析，結果bFGF與MMP-2、MMP/TIMP的表達均呈正相關，r分別為0.967、0.926，P＜0.01。
　　 第五部分
　　 “和血生絡法”對粒細胞集落刺激因子的影響
　　

20、方法：
　　 健康雄性Wistar大鼠通過結扎冠狀動脈左前降支建立實驗性心肌梗死動物模型。選取造模成功大鼠48只，按照隨機數(shù)字表法隨機分為模型組(M)、消心痛組(Y)、和血生絡低劑量組(D)、和血生絡高劑量組(G)，每組12只；另設假手術組(J)大鼠12只。術后24h灌胃給藥，藥物干預3周后，每組取8只大鼠的血清ELISA法檢測G-CSF在血清中的含量。
　　 結果：
　　 1 血清中G-CSF的含量
　　

21、 模型組血清G-CSF含量為31.15±5.12較假手術組15.34土3.02明顯增高(P＜0.05)。和血生絡高劑量組、和血生絡低劑量組、消心痛組血清G-CSF含量分別為66.61±8.46、38.23±9.76、52.59±7.18較模型組明顯增高（P＜0.05）。和血生絡高劑量組、消心痛組較和血生絡低劑量組明顯增高（P＜0.05），且和血生絡高劑量組高于消心痛組(P＜0.05)。
　　 第六部分
　　 “和血生絡

22、法”對PI3K/Akt和MEK/ERK信號轉導通路的影響
　　 方法：
　　 健康雄性Wistar大鼠通過結扎冠狀動脈左前降支建立實驗性心肌梗死動物模型。選取造模成功大鼠48只，按照隨機數(shù)字表法隨機分為模型組(M)、消心痛組(Y)、和血生絡低劑量組(D)、和血生絡高劑量組(G)，每組12只；另設假手術組(J)大鼠12只。術后24h灌胃給藥，藥物干預3周后，每組取6只大鼠心臟組織RT-PCR法檢測AKTmRNA在大鼠左室心

23、肌組織的表達，用BIO-PROFIF凝膠圖象分析系統(tǒng)對目的電泳條帶進行分析，以相應的內參電泳條帶作為參照，結果以兩者之積分吸光度的比值表示。每組取6只大鼠心臟組織Westernblot檢測ERK1/2在大鼠左室心肌組織的表達，用凝膠定量軟件Quantity-One-version4.6.2測定各條帶的積分吸光度，以積分吸光度代表蛋白質的表達量。
　　 結果：
　　 1 AKTmRNA在大鼠左室心肌組織的表達
　　

24、 假手術組大鼠為0.17±0.01，模型組大鼠為0.26±0.02，較假手術組大鼠顯著增高(P＜0.05)。和血生絡高劑量組、和血生絡低劑量組及消心痛組大鼠分別為0.60±0.02、0.42土0.01、0.58±0.01。各治療組明顯高于模型組（P＜0.05）。和血生絡高劑量組與消心痛組明顯優(yōu)于和血生絡高低劑量組。和血生絡高劑量組明顯優(yōu)于消心痛組(P＜0.05)。
　　 2 ERK1/2在大鼠左室心肌組織的表達
　　 假

25、手術組大鼠為25470±1456，模型組大鼠為33703±488，較假手術組大鼠顯著增高(P＜0.05)。和血生絡高劑量組、低劑量組及消心痛組大鼠分別為54335±1021、40146土289、38361±1200，各治療組明顯高于模型組（P＜0.05）。和血生絡高劑量組明顯優(yōu)于和血生絡低劑量組及消心痛組（P＜0.05）。和血生絡低劑量組明顯優(yōu)于消心痛組（P＜0.05）。
　　 結論：
　　 1“和血生絡法”是冠心病的基

26、本治法。
　　 2 和血生絡法能夠縮小心肌梗死范圍，對大鼠心肌梗死具有治療作用。
　　 3 和血生絡法能夠增加心肌梗死邊緣區(qū)MVC/MVD，對缺血心肌具有促血管新生作用，從而有助于局部缺血狀態(tài)的改善。
　　 4 和血生絡法能增強心肌組織中bFGF蛋白和基因的表達，提高血清中bFGF的含量。由于bFGF是血管新生的重要生長因子，所以和血生絡法促進bFGF產(chǎn)生是其促進血管新生的機制之一。
　　 5 和血生絡法

27、能夠促進MMP-2的分泌，改變MMP-2、TIMP-2的比例，從而促進基底膜的降解，有利于內皮細胞的增殖和游走，為血管新生提供保障。
　　 6 和血生絡法能提高血清中G-CSF含量，而G-CSF是骨髓中內皮祖細胞強有力的動員劑，可間接推論和血生絡法通過動員內皮祖細胞進入外周血而促進血管新生。
　　 7 和血生絡方能明顯提高心肌中Akt及ERK1/2的表達量。說明和血生絡法可通過激活Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt