通過調節(jié)JAK2-STAT3和Wnt5a信號通路可能是缺血后處理及低溫減輕全腦缺血性腦損傷的分子機制.pdf

1、目前國內外已經有大量的試驗證實低溫對全腦缺血的腦保護作用。低溫的腦保護作用不僅局限在減少能量代謝和氧耗，還具有抑制興奮性氨基酸釋放、抑制氧自由基的過度形成和細胞內鈣離子(Ca2+)超載，明顯增加腦組織對缺血的耐受性。臨床心臟外科手術體外循環(huán)中已經成功地將不同程度的低溫應用于術中腦保護，特別是深低溫停循環(huán)技術應用于部分嬰幼兒主動脈弓部手術。
　　研究證實JAK蛋白和JAKs蛋白通路廣泛參與細胞的增殖、分化、應激、凋亡以及炎癥反應和免

2、疫調節(jié)等過程。關于JAK-STAT途徑的研究大多集中在腫瘤、肝臟疾病、神經細胞的生成、造血系統(tǒng)疾病和心臟病中研究較多。
　　Wnt基因編碼的Wnt蛋白家族屬于分泌型糖蛋白，它們通過旁分泌或自分泌作用與位于細胞膜上的受體相結合，激活胞內的各級信號傳導分子，調節(jié)靶基因的表達。Wnt/Ca2+通路主要由wnt5a和 wntll激活，可能通過 G蛋白激活PLC(Phospholipase C)和PKC(ProteinkinaseC)，從而

3、引起細胞內Ca2+濃度增加和Ca2+敏感信號成分的激活。近年來，該通路其在炎癥及凋亡中的作用逐漸引起人們的關注。
　　基于以上的理論及研究結果，考慮到嬰幼兒主動脈弓部手術，存在低溫、全腦缺血的過程，我們設計了該課題，以期探討JAK2-STAT3通路和Wnt5a非經典信號通路是否參與低溫和缺血后處理介導腦保護的分子機制，進一步指導臨床應用。本課題分為以下幾個部分：
　　第一部分 探討減輕全腦缺血性腦損傷的最佳缺血后處理方案

4、r>　　目的：探討減輕全腦缺血性腦損傷的最佳缺血后處理方案
　　方法：以成年雄性SD大鼠為研究對象，以四血管阻塞法，夾閉雙側頸總動脈20分鐘，建立大鼠全腦缺血模型為基本方法。開放雙側頸總動脈再灌注前分別采取多種短暫性腦缺血后處理方案，后處理方案包括7組：缺血再灌注組、15秒×1次（15×1）組、15秒×3次（15×3）組、30秒×1次（30×1）組、30秒×3次（30×3）組、60秒×1次（60×1）組，空白組，每組8只SD大鼠。

5、48h后，檢測大鼠神經功能損傷評分后，處死，行前腦切片HE染色和TUNEL染色，Western blot法檢測腦組織bcl-2、caspase-3的表達量，觀察不同缺血后處理方案對全腦缺血后再灌注腦組織的損傷情況。
　　結果：缺血再灌注組大鼠腦額頂葉皮質及相應的皮質下結構可見明顯神經元損傷，而且損傷程度最嚴重。與缺血再灌注組比較，五種缺血后處理方案均能減輕大全腦缺血再灌注所致的腦損傷，但減輕程度不一樣，其中，缺血后處理15x3組效

6、果最明顯。
　　結論：實驗結果顯示，短暫性腦缺血后處理對大鼠全腦腦缺血具有神經保護作用。其中，缺血后處理15秒x3次方案可能是本實驗設計方案中的最佳方案。
　　第二部分 缺血后處理及低溫通過JAK2-STAT3和Wnt5a非經典信號通道減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷。
　　目的：（1）研究JAK2-STAT3和Wnt5a非經典信號通道在大鼠全腦腦缺血后的不同時間的表達。
　　（2）研究JAK2-STAT3和Wnt

7、5a非經典信號通道在缺血后處理及深低溫條件下減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷中的作用。
　　方法：（1）以成年雄性SD大鼠為研究對象，建立大鼠常溫下全腦缺血模型，每組6只SD大鼠，設立空白對照組，在腦缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各設一組，檢測大鼠神經功能損傷評分，免疫組織化學法和western blot法分別檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Wnt5a，β-catenin的表達。

8、>　　（2）另外再設計7組實驗，每組6只SD大鼠，分為缺血再灌注對照組、缺血后處理組、低溫組、缺血后處理+低溫組、缺血后處理+低溫+AG490組、缺血后處理+低溫+特異性Ca2+抑制劑組、缺血后處理+低溫+AG490+特異性Ca2+抑制劑組，全腦腦缺血經處理后恢復灌注24h后檢測大鼠神經功能損傷評分，同時通過western blot法檢測腦組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Wnt5a、的表達的蛋白表達水平。

9、　　結果：大鼠全腦腦缺血再灌注后，p-JAK2、p-STAT3、Wnt5a在大腦皮質的表達24h達到高峰，JAK2、STAT3缺血24h表達最少，β-catenin表達變化不明顯。缺血后處理及低溫均可減輕全腦腦缺血再灌注腦損傷，兩個作用可以相互疊加，兩種保護措施被AG490或特異性Ca2+抑制劑或二者混合物抑制。
　　結論：JAK2-STAT3和 Wnt5a非經典信號通道在全腦腦缺血再灌注后早期被激活，24小時達到高峰。此外，缺血

10、后處理及低溫可能通過調節(jié)JAK2-STAT3和Wnt5a非經典信號通道減輕大鼠全腦腦缺血性再灌注腦損傷。
　　第三部分 通過JAK2-STAT3和Wnt5a非經典信號通道抑制炎癥反應可能是缺血后處理及低溫減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷的機制之一。
　　目的：（1）探討大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷后炎癥反應以及炎癥介質不同時間的表達水平。
　?。?）進一步探討是否通過JAK-STAT和Wnt5a非經典信號通道抑制炎癥反應，

11、從而減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷。
　　方法：（1）以成年雄性SD大鼠為研究對象，建立大鼠常溫下全腦缺血模型，每組6只SD大鼠，設立空白對照組，在腦缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各設一組，分別檢測髓過氧物酶(MPO)的表達含量，以免疫組織化學法和western blot法進一步檢測缺血腦組織促炎癥因子TLR2、TLR4、NF-κB和COX-2的表達水平，用ELISA法檢測大鼠血清TNF-α的含量。

12、　?。?）另外再設計8組實驗，每組6只SD大鼠，分為缺血再灌注對照組、空白對照組、缺血后處理組、低溫組、缺血后處理+低溫組、缺血后處理+低溫+AG490組、缺血后處理+低溫+特異性Ca2+抑制劑組、缺血后處理+低溫組+AG490+特異性Ca2+抑制劑組，全腦腦缺血經處理后恢復灌注24h后，分別檢測各組檢測髓過氧物酶(MPO)的表達含量，大腦組織TNF-α的分泌情況，通過western blot法檢測腦組織促炎癥因子COX-2、NF-κB

13、的表達水平。
　　結果：炎癥標志物MPO含量從腦缺血后24h達到高峰，維持至48h，到72小時逐漸下降，但仍高于正常水平。TLR2、TLR4、COX-2、NF-κB和 TNF-α的表達也于腦缺血后24h達到高峰。缺血后處理及低溫可降低全腦腦缺血再灌注腦損傷后的炎癥反應以及促炎癥因子的表達水平，兩個作用可以相互疊加，兩種保護措施被AG490或特異性Ca2+抑制劑或二者混合物抑制。
　　結論：大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷誘導炎癥反

14、應和促炎癥因子的表達，24小時達到高峰。此外，缺血后處理及低溫通過JAK2-STAT3和Wnt5a非經典信號通道抑制炎癥介質的表達和炎癥反應，這可能是減輕大鼠全腦腦缺血性再灌注腦損傷的機制之一。
　　第四部分 通過JAK2-STAT3和Wnt5a非經典信號通道抑制神經元凋亡可能是缺血后處理及低溫減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷的機制之一。
　　目的：（1）探討大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷后不同時間點神經元凋亡的水平。
　　

15、（2）進一步探討是否通過JAK2-STAT3和Wnt5a非經典信號通道抑制神經元凋亡，從而減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷。
　　方法：（1）以成年雄性SD大鼠為研究對象，建立大鼠常溫下全腦缺血模型，每組6只SD大鼠，設立空白對照組，在腦缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各設一組，以Tunel染色法和western blot法進一步檢測缺血腦組織bcl-2/BAX，caspase-3的表達水平。
　　（2）

16、另外再設計8組實驗，每組6只SD大鼠，分為缺血再灌注對照組、空白對照組、缺血后處理組、低溫組、缺血后處理+低溫組、缺血后處理+低溫+AG490組、缺血后處理+低溫+特異性Ca2+抑制劑組、缺血后處理+低溫組+AG490+特異性Ca2+抑制劑組，全腦腦缺血經處理后恢復灌注24h后，通過大腦HE染色及Tunel染色了解腦細胞凋亡情況，western blot法進一步檢測缺血腦組織bcl-2/BAX，caspase-3的表達水平。
　　

17、結果：全腦腦缺血再灌注腦損傷后缺血腦組織發(fā)生神經元凋亡，凋亡從腦缺血后開始，24h達到高峰，高峰期維持到48-72h，隨后降低，但仍高于正常水平。缺血后處理及低溫可降低全腦腦缺血再灌注腦損傷后的BAX、caspase-3的表達水平，升高bcl-2的表達水平，兩個作用可以相互疊加，兩種保護措施被AG490或特異性Ca2+抑制劑或二者混合物抑制。
　　結論：大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷誘導缺血腦組織神經元凋亡，BAX、caspase-3