hOGG1基因特異性錘頭狀核酶體外切割活性及其在A549細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)效應(yīng)的研究.pdf

1、目的采用分子生物學(xué)技術(shù)與核酶技術(shù)抑制人肺腺癌A549細(xì)胞中DNA氧化損傷修復(fù)基因人8-羥基鳥嘌呤-DNA糖苷酶(Human8-oxoguanineDNAglycosylase1，hOGG1)的表達(dá)，以探討肺癌的發(fā)生與發(fā)展同DNA氧化損傷修復(fù)基因的關(guān)系。 方法運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件人工設(shè)計(jì)并合成錘頭狀核酶基因(Ribozyme，RZ)，將該核酶基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，重組子由BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電

2、泳鑒定及DNA測序證實(shí)。多聚酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)擴(kuò)增錘頭狀核酶作用的靶基因hOGG1保守序列，將PCR擴(kuò)增序列插入體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescriptSK(+)，經(jīng)SpeⅠ和SacⅡ酶切電泳及測序鑒定。采用地高辛(Digoxigenin，DIG)標(biāo)記檢測系統(tǒng)，體外轉(zhuǎn)錄核酶基因及hOGG1基因，獲得核酶與帶有DIG標(biāo)記的底物hOGG1mRNA。通過調(diào)整核酶體外實(shí)驗(yàn)中不同的反應(yīng)條件，確定核酶體外切

3、割實(shí)驗(yàn)方案；然后經(jīng)RNA變性凝膠電泳分離切割片段，真空轉(zhuǎn)印正電荷尼龍膜固定mRNA，再經(jīng)DIG的檢測系統(tǒng)反映核酶對靶基因的體外切割效率。含有核酶基因的重組載體pcDNA3.1(+)-RZ在類似脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6的介導(dǎo)下引入人肺腺癌A549細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscriptase-PCR，RT-PCR)擴(kuò)增耐受新霉素的Neo基因以鑒定陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Humanglyceral

4、dehydes-3-phosphatedehydrogenase，hGAPDH)為內(nèi)參照，RT-PCR法半定量檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中hOGG1mRNA的表達(dá)量。以阿霉素為受試物，MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞存活率的變化，彗星試驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞DNA氧化損傷修復(fù)能力的變化。 結(jié)果經(jīng)酶切電泳及DNA測序證實(shí)合成的核酶基因序列成功克隆入pcDNA3.1(+)中，命名為pcDNA3.1(+)-RZ。經(jīng)酶切電泳及DNA測序證實(shí)PCR擴(kuò)增的hOGG1

5、保守序列成功插入pBluescriptSK(+)，命名為pBluescriptSK(+)-hOGG1。通過尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳及DIG檢測系統(tǒng)證實(shí)體外成功轉(zhuǎn)錄出核酶(RZ)及靶基因hOGG1mRNA。在其它反應(yīng)條件一定的情況下，選擇底物與核酶的摩爾比分別為1：1、1：2、1：4、1：8和1：10；反應(yīng)溫度分別為37℃、42℃和50℃；反應(yīng)時(shí)間分別為30min、60min和90min；緩沖液中Mg2+濃度分別為10mmol/L、15m

6、mol/L和20mmol/L進(jìn)行核酶的體外切割實(shí)驗(yàn)，均未檢測出核酶對靶基因具有切割效應(yīng)。將核酶基因?qū)階549細(xì)胞后，經(jīng)RT-PCR法鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入靶細(xì)胞。半定量RT-PCR法檢測出轉(zhuǎn)染核酶的A549細(xì)胞中hOGG1mRNA表達(dá)量下降36％，與未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞相比有顯著性差異(P＜0.05)。選擇濃度分別為8.00μg/ml、4.00μg/ml、2.00μg/ml、1.00μg/ml、0.25μg/ml、0.01μg/ml

7、和0μg/ml的阿霉素作用于轉(zhuǎn)染前后的A549細(xì)胞，37℃染毒24h，MTT法檢測顯示在相同濃度的阿霉素作用下，轉(zhuǎn)染核酶基因的A549細(xì)胞存活率低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對阿霉素的敏感性增加；分別于轉(zhuǎn)染后0h、24h和48h，1.0μg/ml阿霉素作用轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞24h，彗星試驗(yàn)表明在阿霉素作用下，轉(zhuǎn)染核酶的A549細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA損傷程度增加(P＜0.05)，但無時(shí)效關(guān)系。 結(jié)論成功構(gòu)建hOGG1特異性錘頭狀核酶真核表達(dá)載體及含有