凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白大亞基2種變體的克隆及其免疫學(xué)活性分析.pdf

1、血藍(lán)蛋白是近年來(lái)在對(duì)蝦等無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種具有多種免疫活性的多功能蛋白。有趣的是，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白大亞基（命名為 HcL）可能至少存在42條變體序列（命名為HcLV），但迄今為止，大部分變體的全長(zhǎng)序列及其免疫學(xué)功能尚不清楚。為此，本研究在課題組前期已獲得的3條變體序列（HcLV1-3)的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步采用分子生物學(xué)、免疫學(xué)策略對(duì)另外兩條差異較大的變體序列（HcLV4, HcLV5)進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的研究。

2、所獲主要研究結(jié)果如下：
　　1、2種HcLV全長(zhǎng)cDNA的克隆及序列分析
　　基于數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的HcLV4、HcLV5部分EST序列，采取RACE技術(shù)，克隆HcLV4、HcLV5 cDNA全長(zhǎng)序列，發(fā)現(xiàn)HcLV4、HcLV5 cDNA ORF框分別為2219、2137 bp，編碼672、678個(gè)氨基酸。經(jīng)BLAST比對(duì)，HcLV4、HcLV5氨基酸序列與HcL序列存在90、83％的相似性。兩者均具有血藍(lán)蛋白的典型結(jié)構(gòu)，包括銅

3、離子結(jié)合區(qū)域，保守His位點(diǎn)和Ig-like區(qū)等。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了對(duì)蝦血藍(lán)蛋白變體的存在，為深入了解對(duì)蝦血藍(lán)蛋白的免疫防御機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　2、2種HcLV DNA序列的克隆及多態(tài)性分析
　　根據(jù)已知的HcLV4、HcLV5 cDNA全長(zhǎng)序列，擴(kuò)增HcLV4、HcLV5 DNA序列，獲得HcLV4 DNA5’端序列及HcLV5 DNA全長(zhǎng)序列，HcLV45’端DNA全長(zhǎng)952 bp，無(wú)內(nèi)含子區(qū)域，其與HcLV4

4、cDNA序列同源性為99%；HcLV5 DNA全長(zhǎng)2660 bp，其中含有2個(gè)內(nèi)含子區(qū)域，分別位于80-538 bp處（命名為gHcLV5-I-1）和2064-2227 bp處，其外顯子區(qū)域與HcLV5 cDNA序列同源性為99%。
　　在此基礎(chǔ)之上，采用文庫(kù)構(gòu)建、核酸測(cè)序與序列比對(duì)等技術(shù)進(jìn)一步對(duì)gHcLV5-I-1的多態(tài)性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該內(nèi)含子區(qū)域具有明顯的分子多態(tài)性，且不同組織之間存在組織差異性，根據(jù)其序列變化

5、規(guī)律，所測(cè)序列可進(jìn)一步分為3種亞型。進(jìn)化分析顯示，該3種亞型序列可能通過(guò)缺失突變、點(diǎn)突變等基因突變方式演化而來(lái)。由此說(shuō)明，對(duì)蝦血藍(lán)蛋白大亞基變體序列的多態(tài)性來(lái)源于其DNA水平，且其內(nèi)含子同樣具有高度的分子多態(tài)性。
　　3、1種HcLV的原核表達(dá)及其免疫學(xué)功能研究
　　采用原核表達(dá)、凝集實(shí)驗(yàn)、抑菌實(shí)驗(yàn)、RNAi、免疫刺激等技術(shù)進(jìn)一步對(duì)HcLV4的免疫學(xué)功能進(jìn)行了進(jìn)一步的探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HcLV4重組表達(dá)蛋白（命名為rHcLV4

6、）分子量為96.3kDa，與預(yù)期大小一致，其對(duì)副溶血弧菌等3種細(xì)菌具有明顯的凝集活性，其凝集活性大小為31.25-500μg/ml，約為HcL重組表達(dá)蛋白（rHcL）的2-8倍；與rHcL一致，rHcLV4對(duì)副溶血弧菌同樣具有抑菌活性，且將其注射對(duì)蝦后，可顯著降低對(duì)蝦感染副溶血弧菌之后的死亡率；不過(guò)，與預(yù)期不一致的是，HcLV4基因被 RNAi后，對(duì)蝦感染副溶血弧菌后的死亡率非但沒(méi)有升高反而明顯降低。由此說(shuō)明，對(duì)蝦血藍(lán)蛋白變體（HcLV