姜黃素干預(yù)長鏈非編碼RNA HOTAIR介導(dǎo)腎細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)為泌尿系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率約5～10/10萬，且每年以2％的速度遞增。RCC約占全身惡性腫瘤的3％，占腎臟原發(fā)性惡性腫瘤的85％，其死亡率超過40％。早期RCC患者手術(shù)切除后，仍有20％-30％將發(fā)生轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性RCC預(yù)后較差，中位生存期6～12個月，5年生存率僅9％。因此，侵襲性轉(zhuǎn)移是RCC患者治療失敗的主要原因，所以有效控制侵襲轉(zhuǎn)移是治療RCC

2、的關(guān)鍵。
　　HOX家族中LncRNA-HOTAIR是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反式作用的長鏈非編碼RNA(longchain noncoding RNA，LncRNAs)，它能同時結(jié)合多梳抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex2，PRC2)和組蛋白去甲基化酶復(fù)合體[賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(lysinespecific demethylase1，LSD1)/RE1-沉默轉(zhuǎn)錄因子(RE1-silencin

3、g transcription factor，REST)共阻抑蛋白(Co-repressor of REST，CoREST)/REST]，并介導(dǎo)這2種復(fù)合體結(jié)合到特異性的基因組位點(diǎn)，分別使染色體組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(histone H3tri-methylated at lysine27，H3K27me3)和組蛋白H3第4位賴氨酸二甲基化(histone H3dimethyl Lys4，H3K4me2)，繼而導(dǎo)致基因沉默。<

4、br>　　近年來的研究表明，HOTAIR通過調(diào)控組蛋白的甲基化或乙?；揎椬饔媒閷?dǎo)了乳腺癌、肝癌和結(jié)腸癌腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。還有研究發(fā)現(xiàn):在腎癌樣本中可檢測到HOX基因表達(dá)異常，同時，組蛋白異常的甲基化和乙酰化參與了腎癌侵襲轉(zhuǎn)移，這提示HOX基因表達(dá)異常和組蛋白的異常乙酰化可能是腎癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程的重要事件之一;現(xiàn)已明確姜黃素可以通過干擾組蛋白糾正組蛋白異常的甲基化和乙?；瘉戆l(fā)揮抗癌作用。而其深入的機(jī)制如何，目前尚不清楚。因此，文

5、本假設(shè)姜黃素通過干擾HOTAIR介導(dǎo)組蛋白乙?；瘡亩种颇I癌侵襲轉(zhuǎn)移。
　　目的：
　　本研究擬檢測HOTAIR在腎癌組織中的表達(dá)水平，并從體內(nèi)外研究HOTAIR對腎癌細(xì)胞增殖和趨化運(yùn)動遷移能力的影響。在此基礎(chǔ)上，研究姜黃素對HOTAIR介導(dǎo)的RCC增殖和細(xì)胞遷移運(yùn)動能力的影響。姜黃素是從姜科植物姜黃中提取出來的一種酚類色素，近年來的研究表明，姜黃素不僅具有抗凝、降血脂、抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗類風(fēng)濕、保肝利

6、膽護(hù)胃等多方面作用，而且能夠抑制惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制尚未闡明。本文對姜黃素是否能影響HOTAIR介導(dǎo)的腎癌遷移運(yùn)動能力進(jìn)行了研究，以期對臨床應(yīng)用姜黃素治療轉(zhuǎn)移性RCC以及靶向治療等研究提供新思路和新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.預(yù)實(shí)驗(yàn):收集17例臨床手術(shù)標(biāo)本（每例均包括腎癌原發(fā)灶、腎門轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)病灶、癌旁正常腎組織），檢測HOTAIR的表達(dá)情況，考察腎門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、腎癌組織、癌旁腎組織中的HOTAIR是否表達(dá)及其

7、差異。
　　2.考察實(shí)驗(yàn)室常用的6種人腎癌細(xì)胞株(os-rc-2、ACHN、769-P、Kert-3、786-O、a498)中HOTAIR表達(dá)情況及其增殖和遷移運(yùn)動能力，篩選出低表達(dá)低遷移能力的細(xì)胞株769-P和高表達(dá)高遷移能力的細(xì)胞株786-O作為研究對象，運(yùn)用慢病毒(pLenti GFPPuro-HOTAIR)轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞系769-p后，構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)HOTAIR的細(xì)胞株769-p-HOTAIR，再運(yùn)用shRNA干擾786-O

8、中的HOTAIR，構(gòu)建穩(wěn)定沉默HOTAIR的細(xì)胞株786-O-siRNA，選擇在不影響增殖、凋亡情況下，分別考察它們體外運(yùn)動遷移能力。
　　3.選擇769-P、769-P-NC、769-P-HOTAIR和786-O、786-O-NC、786-O-siRNA進(jìn)行瘤鼠模型的建立，考察他們在體內(nèi)增殖力和轉(zhuǎn)移能力。以及體外、內(nèi)實(shí)驗(yàn)考察姜黃素對細(xì)胞株的遷移運(yùn)動能力和各組瘤鼠的抑制影響情況。
　　結(jié)果：
　　1.各樣本組HOTAI

9、R mRNA均有表達(dá)，轉(zhuǎn)移灶HOTAIR的表達(dá)顯著高于腎癌原發(fā)灶(P=0.0086)和癌旁正常腎組織(P=0.0060);腎癌原發(fā)灶與癌旁正常腎組織中HOTAIRmRNA的表達(dá)組間無顯著差異性(p=0.281)。
　　2.正常腎細(xì)胞HK-2 HOTAR的表達(dá)水平明顯低于三種腎癌細(xì)胞株os-rc-2(P=0.0173)、kert-3(P=0.0011)和786-O(P=0.0003)，高轉(zhuǎn)移性腎癌細(xì)胞系(os-rc-2，786-O)

10、中HOTAIR的水平明顯高于低轉(zhuǎn)移性腎癌細(xì)胞株(achn，769-p)。os-rc-2與achin、769-p比較，P值分別為:0.0186和0.0146;786-O與achin、769-p比較，P值分別為:0.004和0.0007。
　　3.Transwell小室試驗(yàn)檢測五種腎癌細(xì)胞系遷移運(yùn)動能力，786-O、kert-3細(xì)胞遷移運(yùn)動能力均較強(qiáng)，與769-p細(xì)胞比較，均具有顯著差異，P值分別為0.0002，0.0006;與ach

11、n細(xì)胞比較，均具有顯著差異，P值分別為0.0035，0.004;與os-rc-2細(xì)胞比較，均具有顯著差異，P值分別為0.0042，0.0022;
　　4.攜帶HOTAIR的慢病毒載體感染的769-p細(xì)胞的HOTAIR明顯高表達(dá)(P=0.0005)，而攜帶vector的慢病毒載體感染的769-p細(xì)胞的HOTAIR水平無明顯變化(P=0.4810)。兩組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的786-O-siRNA細(xì)胞株HOTAIR mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組

12、786-O細(xì)胞的HOTAIR mRNA表達(dá)水平，(P=0.0003，P=0.00037，)，而陰性對照NC(siGFP)的786-NC細(xì)胞，HOTAIR水平變化不明顯(P=0.1904)。
　　5.在24h和48h769-p-HOTAIR、769-p-NC、769-p細(xì)胞增殖情況組間比較無顯著差異，在72h769-p-HOTAIR組相比769-p、769-p-NC組，細(xì)胞增殖的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.00536，p=0.0092

13、)，此外，769-p-NC組與769-p組也有顯著性差異(p=0.0078)。在24h，786-O-shHOTAIR、786-O-NC、786-O細(xì)胞增殖情況組間比較無顯著差異，在48h和72h，786-O-shHOTAIR組相比786-O-NC、786-O組，細(xì)胞增殖的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。786-O-shHOTAIR在48h相比786-O組，細(xì)胞增殖減少(p=0.0084)，在72h相比786-O組，細(xì)胞增殖減少(p=0.0002);7

14、86-O-shHOTAIR在48h相比786-O-NC組，細(xì)胞增殖顯著性減少(p=0.0042)，在72h相比786-O-NC組，細(xì)胞增殖顯著性減少(p=0.00018);此外，786-O-NC組與786-O組在48h、72h有顯著性增加(p=0.0067， p=0.0053)。
　　6.769-p-HOTAIR相比769-p-NC、769-p細(xì)胞株，遷移運(yùn)動能力顯著增加，P值分別為0.0031，0.0017。769-p-NC與7

15、69-p細(xì)胞株的遷移運(yùn)動能力無顯著性差異。786-O-shHOTAIR相比786-O-NC、786-O細(xì)胞株，遷移運(yùn)動能力顯著降低，P值分別為0.0034，0.0021。786-O-NC與786-O細(xì)胞株的遷移運(yùn)動能力無顯著性差異。
　　7.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示:786-O和786-o-NC組腫瘤體積、瘤重、生長速度的增加幅度比786-o-shRNA大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。769-p-HOTAIR組腫瘤體積、瘤重、生長速度增加的幅度比76

16、9-p、769-p-NC大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　8.姜黃素對4株人腎癌細(xì)胞769-p、769-p-vector、769-p-HOTAIR和786-O的體外實(shí)驗(yàn):姜黃素對四種腎癌細(xì)胞的生長具有抑制作用，且呈時間-劑量依賴性。姜黃素終濃度＞10μM時，細(xì)胞生長抑制作用顯著，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0001～0.0083);姜黃素終濃度≤10μM，在24 h內(nèi)對細(xì)胞的生長無明顯抑制作用。transwell小室法檢測結(jié)果顯示，姜黃素

17、對769-p-HOTAIR、786-O兩種細(xì)胞遷移運(yùn)動均有抑制作用，且呈明顯的劑量依賴性。在姜黃素終濃度≥5μ M時，對細(xì)胞遷移運(yùn)動的抑制作用與對照組相比差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0017～0.0030)。然而，同樣條件下，姜黃素(5-10μ M)對Kert細(xì)胞的遷移運(yùn)動無明顯抑制作用(P=0831～0.1341)。
　　結(jié)論：
　　LncRNA-HOTAIR介導(dǎo)腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的過程，同時本研究還證實(shí)姜黃素可以抑