SCX-IMAC偶聯(lián)LC-MS-MS鑒定磷酸化蛋白組模型的建立.pdf

1、質(zhì)譜技術(shù)是研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的主要手段，而磷酸化是目前研究最為透徹的一種蛋白翻譯后修飾。但是，磷酸化蛋白的豐度較低，因此對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行有效富集是質(zhì)譜鑒定成功的關(guān)鍵。常用的磷酸化肽段富集方法有免疫沉淀法、TiO2層析技術(shù)、IMAC和SIMAC等，隨著磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的日漸成熟，許多研究小組比較了上述磷酸化肽段富集技術(shù)的優(yōu)劣勢(shì)。SCX是最早建立的多維液相分離技術(shù)，其原理是根據(jù)肽段的帶電量不同，逐步提高鹽溶液濃度梯度洗脫SCX柱得到逐

2、級(jí)分離的樣品。近年來，不少實(shí)驗(yàn)室將SCX和IMAC兩種方法結(jié)合起來，在全細(xì)胞磷酸化蛋白組的研究中取得了很好的效果。本論文通過SCX肽段分離，IMAC磷酸化肽段富集以及液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜Triple TOF5600方法鑒定RAW264.7全細(xì)胞磷酸化蛋白組。
　　以約3mg RAW264.7全細(xì)胞蛋白為起始樣品，采用FSAP的方法得到胰蛋白酶酶解肽段，然后將這些肽段進(jìn)行SCX處理得到12個(gè)組分，接著通過IMAC富集每個(gè)組分的磷酸化肽段

3、，將富集到的磷酸化肽段脫鹽處理后進(jìn)行LC-MS/MS分析，最終，得到10331個(gè)非冗余肽段和4348個(gè)非冗余磷酸化肽段。為了驗(yàn)證系統(tǒng)的穩(wěn)定性，以5mg蛋白起始量重復(fù)了上述操作，得到的肽段和磷酸化肽段數(shù)目分別為12217個(gè)和6706個(gè)，后者比文獻(xiàn)報(bào)道（約3900）多出了71.9％。3mg和5mg蛋白起始量得到的磷酸化肽段數(shù)目占總肽段數(shù)目的比例分別為42.1％和54.9％,比文獻(xiàn)報(bào)道的70％略低，可能是蛋白起始量不足引起的。此外，還分析了各