人白三烯C4合成酶熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘兒童體內(nèi)白三烯代謝的影響.pdf

1、目的：在RT-PCR基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(FQPCR)是目前定量最準(zhǔn)確的基因定量技術(shù)，目前國(guó)內(nèi)外尚未建立半胱氨酰白三烯(CysLTs)合成主要限速酶白三烯C4合成酶(LTC4S)表達(dá)水平的FQPCR檢測(cè)方法，本研究擬建立LTC4SmRNA表達(dá)水平的FQPCR檢測(cè)方法，為臨床與基礎(chǔ)研究提供能準(zhǔn)確反映體內(nèi)LTC4S基因表達(dá)水平的檢測(cè)手段，便于進(jìn)一步了解白三烯(LTs)在哮喘發(fā)病機(jī)制中的地位。糖皮質(zhì)激素(GCs)是目前最有

2、效的抗氣道炎癥藥物，吸入糖皮質(zhì)激素(ICS)是哮喘規(guī)范治療的首選用藥，但臨床發(fā)現(xiàn)哮喘兒童對(duì)ICS的治療反應(yīng)具有個(gè)體差異，部分患兒盡管長(zhǎng)期規(guī)律使用ICS病情仍遷延反復(fù)，推測(cè)該部分患兒可能體內(nèi)存在不能被GCs有效抑制的某種(些)炎癥介質(zhì)。CysLTs是參與哮喘氣道炎癥與重塑的重要介質(zhì)，且目前有關(guān)GCs能否有效抑制體內(nèi)CysLTs合成與釋放尚無(wú)一致結(jié)論，因此有理由推測(cè)，CysLTs表達(dá)和合成水平的個(gè)體差異可能是決定哮喘兒童ICS療效的因素之一

3、，目前缺乏相關(guān)的研究。本研究擬比較ICS控制良好與控制不佳兩組哮喘兒童體內(nèi)CysLTs表達(dá)與分泌水平，了解體內(nèi)CysLTs水平的高低是否是決定哮喘兒童ICS療效個(gè)體差異的主要因素之一。另外，本研究同時(shí)觀察口服GCs及吸入ICS對(duì)哮喘兒童CysLTs基因表達(dá)和分泌水平的影響，進(jìn)一步明確GCs能否有效抑制哮喘兒童體內(nèi)CysLTs的合成，可望為哮喘藥物的發(fā)展及最佳聯(lián)合用藥方案的選擇提供依據(jù)。方法：1.本研究通過(guò)基因克隆方法，構(gòu)建含人LTC4S

4、cIDNA的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從而建立LTC4SmRNA的RT-FQPCR檢測(cè)方法，用于檢測(cè)外周血多型核白細(xì)胞LTC4S的表達(dá)；應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)尿LTE4水平。2.選取5～12歲已規(guī)律使用ICS3個(gè)月以上非急性發(fā)作期哮喘兒童32例，按病情分為ICS控制良好與ICS控制不良組，5～12歲健康兒童10例作為對(duì)照組，觀察外周血多型核白細(xì)胞(PMNL)LTC4SmRNA表達(dá)與尿LTE4分泌水平。3.選取非急性發(fā)作期5～12歲

5、哮喘兒童10例，予口服強(qiáng)的松1mg/Kg(最大劑量為20mg/d)，每日晨間頓服，治療期為1周。觀察治療前后外周血PMNLLTC4SmRNA表達(dá)與尿LTE4分泌水平。4.選取5～12歲既往無(wú)使用過(guò)ICS的非急性發(fā)作期哮喘兒童共10例，采用都保干粉吸入裝置吸入布地奈德(BUD)800μg/d，療程4周，觀察治療前后外周血PMNLLTC4SmRNA表達(dá)與尿LTE4分泌水平。 結(jié)果：1.哮喘兒童組外周血PMNLLTC4SmRNA表達(dá)水

6、平明顯高于健康對(duì)照組兒童，其中ICS控制不良組表達(dá)水平最高，與ICS控制良好組和健康對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P均＜0.05)，但I(xiàn)CS控制良好組和健康對(duì)照組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(p＞0.05)。哮喘兒童組與健康對(duì)照組尿LTE4分泌水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(p＞0.05)，ICS控制良好組、ICS控制不良組及健康對(duì)照組之間比較尿LTE4分泌水平也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(p均＞0.05)。ICS使用≥12月的哮喘兒童外周血PMNLLTC4S

7、mRNA表達(dá)水平明顯低于使用ICS＜12月的患兒，但仍顯著高于健康對(duì)照組，提示長(zhǎng)程規(guī)范ICS治療可一定程度降低哮喘兒童CysLTs合成主要限速酶的表達(dá)。2.哮喘兒童口服強(qiáng)的松1周后外周血PMNLLTC4SmRNA及尿LTE4分泌水平與口服前比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異，提示短程全身用激素不能有效抑制哮喘兒童體內(nèi)CysLTs合成。3.既往無(wú)使用過(guò)ICS的哮喘兒童吸入BUD800ug/d治療1月后外周血PMNLLTC4SmRNA及尿LTE4分泌水

8、平均有下降趨勢(shì)，但未達(dá)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示較短程使用ICS不能有效抑制哮喘兒童體內(nèi)CysLTs合成，但延長(zhǎng)規(guī)律使用ICS的時(shí)間有可能有效控制哮喘患兒體內(nèi)CysLTs合成。 結(jié)論：1.FQPCR法檢測(cè)LTC4SmRNA表達(dá)水平能較尿LTE4更敏感反映哮喘兒童CysLTs表達(dá)水平，該方法的建立可為臨床與基礎(chǔ)研究提供能更準(zhǔn)確反映體內(nèi)LTC4S基因表達(dá)水平的檢測(cè)手段，便于進(jìn)一步了解LTs在哮喘發(fā)病機(jī)制中的地位，并為哮喘藥物的發(fā)展和療效的

9、評(píng)估提供客觀依據(jù)。2.哮喘兒童LTC4SmRNA表達(dá)水平增高，且規(guī)范使用ICS控制不良組顯著高于ICS控制良好組兒童，提示CysLTs表達(dá)和合成水平明顯增高可能是個(gè)體長(zhǎng)程規(guī)范使用ICS控制不良的原因之一。3.短程全身用激素或較短程(＜1年)吸入糖皮質(zhì)激素均不能有效抑制哮喘患者體內(nèi)CysLTs合成，哮喘兒童長(zhǎng)程規(guī)范使用ICS(＞1年)其CysLTs表達(dá)水平下調(diào)但仍高于健康對(duì)照組，為選擇吸入ICS與口服白三烯調(diào)節(jié)劑聯(lián)合治療方案治療兒童哮喘提