羅格列酮對(duì)高糖條件下NIT-1細(xì)胞FoxO1、TSC2表達(dá)及細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的: 探討不同濃度葡萄糖及羅格列酮干預(yù)對(duì)胰島β細(xì)胞株 NIT-1的FoxO1、TSC2基因表達(dá)的影響及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分泌功能的影響。
　　方法: 將NIT-1細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),按培養(yǎng)液里葡萄糖濃度不同,分為五組:1組(含5.6mmol/L葡萄糖)、2組(11.1mmol/L)、3組(16.7mmol/L),4組(22.5mmol/L)及5組(27.6mmol/L),每組均先用11.1 mmol/L培養(yǎng)液常規(guī)培

2、養(yǎng)48小時(shí),再分別換成不同糖濃度培養(yǎng)液進(jìn)行處理培養(yǎng),培養(yǎng)至第120小時(shí)。每組細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后,分別加入不同濃度的羅格列酮進(jìn)行干預(yù),加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),來檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。采用MTT比色法檢測(cè)各組 NIT-1細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性;放射免疫分析法檢測(cè)各組 NIT-1細(xì)胞胰島素分泌水平;免疫熒光細(xì)胞核染色法檢測(cè)各組 NIT-1細(xì)胞凋亡水平;免疫熒光和蛋白印跡方法檢測(cè)NIT-1細(xì)胞中p-FoxO1蛋白的表達(dá)水平;RT-PCR方法檢測(cè)各組NIT-1

3、細(xì)胞中FoxO1、TSC2基因mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果: 隨著葡萄糖濃度的增加,NIT-1細(xì)胞增殖水平呈先升后降改變,葡萄糖濃度為11.1 mmol/L時(shí),細(xì)胞增殖率最高,5.6mmol/L組低于11.1mmol/L組(P<0.05),16.7mmol/L組、22.5mmol/L組、27.6mmol/L組細(xì)胞增殖率逐漸降低(P<0.05);胰島素分泌量11.1mmol/L組最高,隨著葡萄糖濃度的增加16.7mmol/L組、2

4、2.5mmol/L組、27.6mmol/L組逐漸減低,組間差異明顯(P<0.05),但均多于5.6mmol/L組(P<0.05);同5.6mmol/L組、11.1mmol/L組進(jìn)行比較,16.7mmol/L組、22.5mmol/L組、27.6mmol/L組細(xì)胞凋亡逐漸出現(xiàn)(P<0.05),其中11.1mmol/L組細(xì)胞凋亡率最低;通過免疫熒光和蛋白印跡檢測(cè)方法進(jìn)行定位定量分析,NIT-1細(xì)胞中 p-FoxO1蛋白表達(dá)水平在葡萄糖濃度為1

5、1.1mmol/L時(shí)最高,而隨著葡萄糖濃度的逐級(jí)升高,p-FoxO1蛋白表達(dá)逐漸減少(P<0.05);RT-PCR結(jié)果顯示NIT-1細(xì)胞中FoxO1與TSC2基因mRNA在葡萄糖濃度為5.6mmol/L時(shí)表達(dá)最低,而隨著葡萄糖濃度升高, FoxO1與TSC2mRNA的表達(dá)呈不斷增加狀態(tài),各組間均有差異(P<0.05);予羅格列酮干預(yù)后各組NIT-1細(xì)胞增殖水平、胰島素分泌量、及p-FoxO1蛋白表達(dá)水平均上升,各組細(xì)胞凋亡率及FoxO1

6、與TSC2mRNA的表達(dá)均減少。
　　結(jié)論: 體外培養(yǎng)NIT-1細(xì)胞的最適宜葡萄糖濃度為11.1mmol/L,在此葡萄糖濃度下,胰島β細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,胰島素分泌和細(xì)胞增殖可達(dá)最高狀態(tài);隨著葡萄糖濃度的升高(>11.1mmol/L),胰島β細(xì)胞凋亡亦增高,細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,并出現(xiàn)胰島素分泌功能缺陷導(dǎo)致胰島素分泌水平下降;加入羅格列酮以后細(xì)胞增殖與胰島素分泌水平增加,細(xì)胞凋亡減少。高濃度葡萄糖(>11.1mmol/L)使p-FoxO

7、1蛋白表達(dá)水平降低,同時(shí)使FoxO1基因mRNA表達(dá)水平升高,因此我們推測(cè)通過 FoxO1核定位的增加,一方面可增強(qiáng)細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)凋亡基因的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡,另一方面通過抑制過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ)的轉(zhuǎn)錄活性,影響細(xì)胞胰島素的分泌,并增加細(xì)胞對(duì)胰島素的抵抗作用;給予 PPARγ的強(qiáng)效激動(dòng)劑羅格列酮干預(yù)以后, NIT-1細(xì)胞FoxO1表達(dá)減少,同時(shí)TSC2表達(dá)也減少。這一結(jié)果提示我們FoxO1與 TSC2在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通