邊緣無漿體MSP5基因的克隆、原核表達(dá)及ELISA方法的建立.pdf

1、邊緣無漿體病是由蜱傳播的、邊緣無漿體寄生于牛紅細(xì)胞內(nèi)所引起的立克氏體病.該病幾乎遍布我國各省(區(qū)),嚴(yán)重威脅著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展. 本試驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表的:MSP5基因序列,設(shè)計(jì)引物,利用PCR技術(shù)自感染邊緣無漿體基因組DNA中擴(kuò)增MSP5基因,通過將產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接,構(gòu)建重組克隆載體pGEM-TEasy-MSP5.基因測序結(jié)果表明,本試驗(yàn)所獲得的.MSP5基因核苷酸序列和所編碼氨基酸的序列與GenBank中收錄的邊緣

2、無漿體國外株的同源性分別為98.6﹪和99﹪.根據(jù)開放閱讀框(ORF)兩側(cè)序列重新設(shè)計(jì)并合成表達(dá)引物,以重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-MSP5為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEX-4T-1質(zhì)粒連接,構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-MSP5,將其轉(zhuǎn)化到DH5a宿主菌中,用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),所表達(dá)的目的蛋白部分為分泌性表達(dá),大部分呈包涵體.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,MSP5基因在大腸桿菌中成

3、功獲得了表達(dá),目的蛋白約占菌體總蛋門的35.0﹪,并與GST形成融合形式,分子量大小為45Ku左右,與預(yù)期的大小相吻合,且可被兔抗牛邊緣無漿體陽性血清所識(shí)別. 通過裂解、洗滌、變性、復(fù)性等方法對包涵體蛋白進(jìn)行處理,以所獲得的純化產(chǎn)物作為抗原,構(gòu)建了ELISA診斷方法;實(shí)驗(yàn)證實(shí),該方法的陽性符合率和陰性符合率分別為100﹪(100/100)和98﹪(98/100):對實(shí)驗(yàn)感染牛的抗體消長規(guī)律進(jìn)行了觀察,結(jié)果顯示,動(dòng)物感染后第5天即

4、可查出抗體(滴度為1:50),第90天時(shí)抗體達(dá)到高峰(滴度為1:3200),然后逐漸下降,感染后第5個(gè)月抗體效價(jià)為1:1600;對自新疆、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、四川和甘肅六省區(qū)的血清樣品進(jìn)行了檢測,陽性率分別為67.63﹪(700/1035)、81.78﹪(184/225)、82.78﹪(149/180)、 46.11﹪(139/180)、66.67﹪(83/180)和77.22﹪(90/135),結(jié)果與過去采用病原學(xué)檢測獲得的結(jié)果基本