rAAV2介導hBDNF基因聯(lián)合游泳訓練對脊髓損傷大鼠治療作用的實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　1、構建以綠色熒光蛋白基因（Green fluorescence protein，GFP）為報告基因并攜帶人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）基因的2型重組腺相關病毒載體（rAAV2-BDNF-GFP）。
　　2、大鼠脊髓損傷造模成功后，對其進行基因治療和游泳康復訓練，通過對其行為學、組織學和免疫組織化學的分析評價，以及與單一干預方法之間的比較，

2、探討基因治療聯(lián)合游泳康復訓練對脊髓損傷的保護作用和影響。
　　研究方法：
　　1、以原有質(zhì)粒pTRGDNFGFP為模板，構建含有人BDNF cDNA片段的重組質(zhì)粒pTRBDNFGFP并與AAV病毒包裝質(zhì)粒pAAV-RC、pHelper用PEI法共轉染HEK293T細胞。包裝獲得表達BDNF的2型重組腺相關病毒載體（rAAV2-BDNF-GFP）。
　　2、采用“氯仿處理-PEG/Nacl沉淀-氯仿抽提”3個步驟純化病毒

3、。SDS-PAGE法檢測病毒純度，并用實時熒光定量PCR檢測病毒滴度。重組病毒感染HEK293細胞后，采用Western Blot方法檢測細胞BDNF蛋白表達情況。
　　3、90只健康成年雄性SD大鼠隨機分為5組，分別為單純游泳訓練組（A組，n=18），單純基因治療組（B組，n=18），基因治療聯(lián)合游泳訓練組（C組，n=18），假手術組（D組，n=18），自然愈合組（E組，n=18）。假手術組大鼠只敲除椎板暴露脊髓即可。其余4組采

4、用改良Allen’s打擊法制造大鼠脊髓損傷模型。
　　4、分別在造模前1d，造模后1d、3d、7d、14d、28d、42d對實驗大鼠進行后肢運動功能評分（BBB評分和斜扳試驗）。造模后14d、28d、42d三個時間點取材，每組隨機抽取6只大鼠。取大鼠損傷段脊髓，制作冰凍切片后行HE染色和免疫組織化學染色。
　　5、免疫組化染色切片用圖像分析軟件Image-pro plus 6.0分析處理。各種統(tǒng)計學處理采用統(tǒng)計學軟件SPSS

5、17.0進行分析。
　　研究結果：
　　1、成功構建了重組質(zhì)粒pTRBDNFGFP；包裝制備了2型重組腺相關病毒，純化濃縮后病毒滴度為6.8331011vp/ml；熒光顯微鏡下可觀察到被病毒感染后的HEK293細胞因表達GFP而發(fā)出綠色熒光；Western Blot檢測證明被重組病毒感染后的HEK293細胞具有表達BDNF的能力；
　　2、BBB評分和斜板實驗結果顯示，聯(lián)合治療組在14d、28d、42d的各個時間點與單

6、一方法干預組（P<0.05）和自然愈合組（P<0.01）比較均有顯著提高，而單一方法干預組與自然愈合組比較也有顯著提高（P<0.05）。假手術組在損傷一周后即開始表現(xiàn)出與正常大鼠相似的運動功能。自然愈合組BBB評分和斜扳實驗結果有所提高，但沒有統(tǒng)計學意義；HE染色切片鏡下觀察發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組、單純游泳訓練組和單純基因治療組與自然愈合組相比空洞和瘢痕較少，其中聯(lián)合治療組較為明顯；脊髓前角運動神經(jīng)元存活數(shù)量統(tǒng)計結果顯示，相對于單一方法治療組和

7、自然愈合組，聯(lián)合治療組神經(jīng)元存活的數(shù)量較多（P<0.05）；免疫組化染色結果顯示，聯(lián)合治療組平均光密度值明顯高于其它三組，有顯著統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　研究結論：
　　1、成功包裝2型重組腺相關病毒rAAV2-BDNF-GFP。
　　2、rAAV2-BDNF-GFP可以在脊髓組織中穩(wěn)定的表達BDNF蛋白，有助于軸突的再生，有利于神經(jīng)元的存活，從而促進損傷脊髓部分功能的恢復。
　　3、合理的游泳訓練和基因