胰島素對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷的研究.pdf

1、[目的]
　　探討正常及高濃度葡萄糖(high glucose)條件下，.胰島素(insulin)對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（cultured human retinal pigment epithelial cells-19，ARPE-19）細(xì)胞生長(zhǎng)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成、線粒體DNA氧化損傷標(biāo)記物8-羥基鳥嘌呤（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）及

2、DNA氧化損傷修復(fù)標(biāo)記物8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(human8-oxoguanine DNA glycosylase1，hOGG1)表達(dá)的影響。
　　[方法]
　　體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（cultured human retinal pigment epithelialcells-19，ARPE-19），分別置于5.6mmol/L葡萄糖（正常葡萄糖組）及30mmol/L葡萄糖（高糖組）條件下培養(yǎng)，以不同濃度胰島素(0

3、U/L、100U/L、101U/L、102 U/L、103 U/L、104U/L)分別予以干預(yù)，各組培養(yǎng)12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)，以噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)視網(wǎng)膜色數(shù)上皮細(xì)胞增生活力;ARPE-19細(xì)胞置于5.6mmol/L葡萄糖及30mmol/L葡萄糖條件下培養(yǎng)，以103U/L，104U/L胰島素分別予以干預(yù)，干預(yù)12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)，以2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorofluore scin-

4、diacetate，DCFH-DA)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)的產(chǎn)生情況，以免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry，ICC)方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)8-OHdG的表達(dá)量，以蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)胞漿中hOGG1的表達(dá)量。
　　[結(jié)果]
　　1、MTT法顯示:不同濃度(0U/L、100U/L、101U/L、102 U/L、103 U/L、104U/L)

5、胰島素干預(yù)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，正常濃度葡萄糖組及高濃度葡萄糖組的RPE細(xì)胞的增殖活力差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、DCFH-DA法:在正常濃度葡萄糖組，在各觀察時(shí)間點(diǎn)，胰島素濃度103U/L、104U/L干預(yù)組的ROS表達(dá)量與空白對(duì)照組相比，ROS表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在12小時(shí)胰島素濃度104U/L干預(yù)組的ROS表達(dá)量與胰島素濃度103U/L干預(yù)組相比增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

6、0.05);細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)量隨103U/L、104U/L胰島素作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加的趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　在高濃度葡萄糖組，12、48小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量隨胰島素濃度的升高呈增加的趨勢(shì);胰島素干預(yù)組均顯示細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)量較空白對(duì)照組增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);胰島素濃度104U/L干預(yù)組的ROS表達(dá)量與胰島素濃度103U/L干預(yù)組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。24小時(shí)，

7、胰島素濃度103U/L的干預(yù)組與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，胰島素濃度104U/L干預(yù)組的ROS表達(dá)量與空白對(duì)照組、103U/L干預(yù)組相比，ROS表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)胰島素濃度為0U/L、103U/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)量隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加的趨勢(shì)，24h組與12h組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，48h組與12h、24h組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);當(dāng)胰島素濃度為104U/L

8、時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)量隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加的趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、免疫細(xì)胞化學(xué)法:在正常濃度葡萄糖組，在各觀察時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)8-OHdG表達(dá)量隨胰島素濃度的升高呈增加的趨勢(shì)，胰島素濃度103U/L、104U/L干預(yù)組的8-OHdG表達(dá)量與空白對(duì)照組相比，8-OHdG表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);12小時(shí)，胰島素濃度104U/L干預(yù)組的8-OHdG表達(dá)量與103U/L干預(yù)組相比增高，

9、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)胰島素濃度為104U/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)8-OHdG的表達(dá)量隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加的趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　在高濃度葡萄糖組，在各觀察時(shí)間點(diǎn)，RPE細(xì)胞8-OHdG表達(dá)量隨胰島素濃度的升高呈增加的趨勢(shì)，胰島素濃度103U/L、104U/L的干預(yù)組與空白對(duì)照組相比，8-OHdG表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);胰島素濃度104U/L干預(yù)組的8-OHdG表達(dá)量與胰島素濃

10、度103U/L干預(yù)組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。當(dāng)胰島素濃度為103U/L、104U/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)8-OHdG的表達(dá)量隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加的趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、蛋白免疫印跡法:在正常濃度及高濃度葡萄糖組，在各觀察時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)hOGG1表達(dá)量隨胰島素濃度的升高呈增加的趨勢(shì)，胰島素濃度103U/L、104U/L的干預(yù)組均顯示細(xì)胞內(nèi)hOGG1的表達(dá)量較空白對(duì)照組增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

11、＜0.05);胰島素濃度104U/L干預(yù)組的hOGG1表達(dá)量與胰島素濃度103U/L干預(yù)組相比，增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)胰島素濃度分別為103U/L、104U/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)hOGG1的表達(dá)量隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而有增加的趨勢(shì)，.差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　[結(jié)論]
　　1.無(wú)論在正常狀態(tài)還是高糖狀態(tài)下，胰島素對(duì)RPE細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。
　　2.無(wú)論在正常狀態(tài)還是高糖狀態(tài)下，高濃度胰島素