胰島素對人視網膜色素上皮細胞氧化損傷的研究.pdf

1、[目的]
　　探討正常及高濃度葡萄糖(high glucose)條件下，.胰島素(insulin)對人視網膜色素上皮細胞（cultured human retinal pigment epithelial cells-19，ARPE-19）細胞生長、活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成、線粒體DNA氧化損傷標記物8-羥基鳥嘌呤（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）及

2、DNA氧化損傷修復標記物8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(human8-oxoguanine DNA glycosylase1，hOGG1)表達的影響。
　　[方法]
　　體外培養(yǎng)人視網膜色素上皮細胞（cultured human retinal pigment epithelialcells-19，ARPE-19），分別置于5.6mmol/L葡萄糖（正常葡萄糖組）及30mmol/L葡萄糖（高糖組）條件下培養(yǎng)，以不同濃度胰島素(0

3、U/L、100U/L、101U/L、102 U/L、103 U/L、104U/L)分別予以干預，各組培養(yǎng)12小時、24小時、48小時，以噻唑藍(MTT)比色法檢測視網膜色數(shù)上皮細胞增生活力;ARPE-19細胞置于5.6mmol/L葡萄糖及30mmol/L葡萄糖條件下培養(yǎng)，以103U/L，104U/L胰島素分別予以干預，干預12小時、24小時、48小時，以2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorofluore scin-

4、diacetate，DCFH-DA)法檢測細胞內活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)的產生情況，以免疫細胞化學(immunocytochemistry，ICC)方法檢測細胞內8-OHdG的表達量，以蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測胞漿中hOGG1的表達量。
　　[結果]
　　1、MTT法顯示:不同濃度(0U/L、100U/L、101U/L、102 U/L、103 U/L、104U/L)

5、胰島素干預體外培養(yǎng)的人視網膜色素上皮細胞，正常濃度葡萄糖組及高濃度葡萄糖組的RPE細胞的增殖活力差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2、DCFH-DA法:在正常濃度葡萄糖組，在各觀察時間點，胰島素濃度103U/L、104U/L干預組的ROS表達量與空白對照組相比，ROS表達量增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在12小時胰島素濃度104U/L干預組的ROS表達量與胰島素濃度103U/L干預組相比增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜

6、0.05);細胞內ROS的表達量隨103U/L、104U/L胰島素作用時間的延長呈增加的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　在高濃度葡萄糖組，12、48小時，細胞內ROS表達量隨胰島素濃度的升高呈增加的趨勢;胰島素干預組均顯示細胞內ROS的表達量較空白對照組增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);胰島素濃度104U/L干預組的ROS表達量與胰島素濃度103U/L干預組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。24小時，

7、胰島素濃度103U/L的干預組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，胰島素濃度104U/L干預組的ROS表達量與空白對照組、103U/L干預組相比，ROS表達量增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。當胰島素濃度為0U/L、103U/L時，細胞內ROS的表達量隨作用時間的延長呈增加的趨勢，24h組與12h組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，48h組與12h、24h組具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);當胰島素濃度為104U/L

8、時，細胞內ROS的表達量隨作用時間的延長呈增加的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3、免疫細胞化學法:在正常濃度葡萄糖組，在各觀察時間點，細胞內8-OHdG表達量隨胰島素濃度的升高呈增加的趨勢，胰島素濃度103U/L、104U/L干預組的8-OHdG表達量與空白對照組相比，8-OHdG表達量增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);12小時，胰島素濃度104U/L干預組的8-OHdG表達量與103U/L干預組相比增高，

9、差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。當胰島素濃度為104U/L時，細胞內8-OHdG的表達量隨作用時間的延長呈增加的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　在高濃度葡萄糖組，在各觀察時間點，RPE細胞8-OHdG表達量隨胰島素濃度的升高呈增加的趨勢，胰島素濃度103U/L、104U/L的干預組與空白對照組相比，8-OHdG表達量增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);胰島素濃度104U/L干預組的8-OHdG表達量與胰島素濃

10、度103U/L干預組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。當胰島素濃度為103U/L、104U/L時，細胞內8-OHdG的表達量隨作用時間的延長呈增加的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4、蛋白免疫印跡法:在正常濃度及高濃度葡萄糖組，在各觀察時間點，細胞內hOGG1表達量隨胰島素濃度的升高呈增加的趨勢，胰島素濃度103U/L、104U/L的干預組均顯示細胞內hOGG1的表達量較空白對照組增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P

11、＜0.05);胰島素濃度104U/L干預組的hOGG1表達量與胰島素濃度103U/L干預組相比，增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。當胰島素濃度分別為103U/L、104U/L時，細胞內hOGG1的表達量隨作用時間的延長而有增加的趨勢，.差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　[結論]
　　1.無論在正常狀態(tài)還是高糖狀態(tài)下，胰島素對RPE細胞的增殖無明顯影響。
　　2.無論在正常狀態(tài)還是高糖狀態(tài)下，高濃度胰島素