正向遺傳學方法研究DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1在斑馬魚定向造血過程中的生物學意義.pdf

1、造血干細胞具有自我更新能力，并且可以向下游分化形成各種前體細胞和成熟血細胞。造血干細胞異常增殖和分化都可以導致嚴重的血液疾病。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了部分與造血干細胞自我更新以及分化相關(guān)的基因，如bmi1，hoxB4，wnt，pten，hedghog等，但是對整個分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認識還十分局限。斑馬魚的造血調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與人類高度保守，因此，我們運用斑馬魚為模式生物篩選更多新的與造血干細胞自我更新及分化相關(guān)的基因。
　　我們運用N-乙基-N-

2、亞硝基脲(ENU)為化學誘變劑處理雄性斑馬魚，保種獲得了近1000家攜帶有突變基因的斑馬魚家系。通過運用標記定向造血干細胞的分子標記cmyb來篩選具有造血干細胞異常的突變家系，最終獲得了200多個突變家系。
　　通過經(jīng)典的三代遺傳學篩選，本課題最終選定了Idd794突變家系進行定位克隆，進一步闡述導致Idd794造血干細胞異常的分子機制。
　　通過定位克隆，我們發(fā)現(xiàn)Idd794造血干細胞異常是由于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(Dnmt

3、1)中的點突變導致蛋白翻譯的提前終止。截斷的Dnmt1缺失了DNA甲基化催化結(jié)構(gòu)域，失去了甲基轉(zhuǎn)移酶活性。Dnmt1可以通過對新復制的DNA加上甲基基團來調(diào)控基因的表達，但是其對造血調(diào)控的分子機制并不清楚。
　　在dnmt1突變的胚胎中，定向造血干細胞的分子標記cmyb從受精后36小時(36hpf)開始就開始減少，到5dpf時完全缺失。全胚胎dUTP缺口標記(TUNEL)及造血干細胞的雙標實驗顯示細胞沒有發(fā)生異常的凋亡。通過磷酸化

4、組蛋白3(PH3)的免疫熒光標記實驗，我們發(fā)現(xiàn)dnmt1突變胚胎中造血干細胞的增殖能力顯著減弱。進一步的分子機制研究發(fā)現(xiàn)增殖能力減弱是由cebpa基因表達上調(diào)所引起的，同時發(fā)現(xiàn)cebpa基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域DNA甲基化水平明顯降低。過表達轉(zhuǎn)錄抑制形式的融合蛋白SUMO2-C/ebpa可以恢復造血干細胞減少的表型。同時，在dnmt1及cebpa雙突變的胚胎中造血干細胞數(shù)量仍可維持正常，說明cebpa是Dnmt1對造血干細胞調(diào)控所必需的一個基