山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫的構(gòu)建與分析.pdf

1、葡萄是世界范圍內(nèi)重要的果樹樹種,也是栽培品種最多的物種之一。葡萄鮮果除鮮食外,又可作為釀酒、制干、制汁等原料而具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。山葡萄是我國重要的野生果樹資源,具有極強(qiáng)的抗寒性,是我國東北地區(qū)釀造葡萄酒的主要原料。轉(zhuǎn)色期作為非躍變型果實(shí)特有的一個(gè)生長階段,是漿果在大小、硬度、色澤以及內(nèi)部生理生化發(fā)生劇烈變化的時(shí)期。為了獲得大量山葡萄功能基因信息,并以此為基礎(chǔ)篩選感興趣的目的基因,本文構(gòu)建了山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮的cDNA文庫,并進(jìn)行了較高通

2、量的EST測(cè)序和生物信息學(xué)分析。主要的研究成果如下:
　　 1、采用改良的CTAB法提取山葡萄轉(zhuǎn)色期(50％著色)果皮的總RNA,通過LD-PCR反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,以pDNR-LIB為載體,采用電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α中,構(gòu)建了山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫。文庫插入片段大小為0.5 kb～2 kb之間,平均約為0.8 kb。原始文庫滴度為1.12×106 pfu·mL-1,擴(kuò)增后的文庫滴度為2.82×109pfu·

3、mL-1,重組率接近100％,表明所構(gòu)建的cDNA文庫質(zhì)量高,完整性好。
　　 2、從山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫中隨機(jī)挑取1009個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序,去除載體以及低質(zhì)量序列后,共獲得974條高質(zhì)量序列,占全部測(cè)序量的96.53％。將其進(jìn)行GenBank提交,獲得登錄號(hào)為GW666520～GW667493。利用phrap軟件進(jìn)行拼接,共獲得710個(gè)unigenes,其中包括126個(gè)contigs和584個(gè)singlets,非冗余序

4、列占全部序列的72.90％。一致序列的有效長度分布在102 bp～1024.bp,平均長度為431.35 bp。
　　 3、將獲得的710條unigenes進(jìn)行功能注釋,結(jié)果表明,有528個(gè)unigenes(代表722條EST)與數(shù)據(jù)庫中的已知基因具有高同源性。結(jié)合擬南芥功能基因分類標(biāo)準(zhǔn),把通過BlastX比對(duì)獲得的功能描述基因(包括功能確定及推測(cè)功能的)分為10類,即能量代謝相關(guān)基因(Energy/Metabolism)占17

5、.46％、蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因(Proteinsynthesis)占7.46％、運(yùn)輸體/細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)基因(Transporters/Intracellular traffic)占5.07％、抗病防御相關(guān)基因(Disease/Defence)占6.62％、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)基因(Cellstructure)占1.83％、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(Signal transduction)占3.24％、蛋白定向與儲(chǔ)藏蛋白相關(guān)基因(Protein desti

6、nation and storage)占2.82％、細(xì)胞生長相關(guān)基因(Cellgrowth and division)占1.27％、轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因(Transcription)占1.83％,以及功能不明確基因(Unclassifled)占26.76％。
　　 4、從構(gòu)建的山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫中選取與花色苷生物合成相關(guān)的調(diào)節(jié)基因進(jìn)行全長的克隆和生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)錄因子MYBA3基因的cDNA全長序列為764 bp,