高溫誘導(dǎo)的甘藍(lán)抑制性差減雜交文庫構(gòu)建及其ESTs分析.pdf

1、結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea var.capitata）簡稱甘藍(lán)，起源于地中海沿岸，16世紀(jì)時傳入我國。由于甘藍(lán)抗逆性強，適應(yīng)性廣，容易栽培，目前在世界各地均有栽培，也成為我國各地普遍種植的一種重要蔬菜。甘藍(lán)是一種喜冷涼的蔬菜作物，其結(jié)球期適溫為15-20℃，能適應(yīng)的溫度為7～25℃，超過25℃則同化減弱，呼吸加強，結(jié)球疏散，品質(zhì)和產(chǎn)量降低。因此，高溫已成為甘藍(lán)生產(chǎn)的限制因子，生產(chǎn)上迫切需要解決高溫危害的問題。然而，只有

2、深入研究甘藍(lán)的耐熱機制，才能從根本上解決這個問題。本研究運用抑制性差減雜交（SSH）技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫，應(yīng)用EST技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，通過對甘藍(lán)耐熱相關(guān)基因的表達(dá)分析，從基因水平來研究甘藍(lán)耐熱機制。為今后的甘藍(lán)耐熱遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。
　　 本試驗以耐熱結(jié)球甘藍(lán)自交系“夏皇6-105”為材料，構(gòu)建了經(jīng)高溫誘導(dǎo)0.25h、1h、3h、6h、12h后的甘藍(lán)葉片混合SSHcDNA文庫。共得到1010個單菌落，其中自斑839個

3、，隨機挑取300個陽性克隆經(jīng)反向Northern雜交驗證，107個陽性克隆提取質(zhì)粒后測序，共得到105條高質(zhì)量的ESTS。CAP3軟件聚類后共獲得45個Unigenes，包括7個Contigs和38個Singlets。利用BLASTx、BLASTn在Genbank數(shù)據(jù)庫對這45條Unigenes進(jìn)行同源性比對，熱激蛋白10個，種類有ATHSP101、HSP70、HSP81.4、HSP70b、HSP22、HSP21、HSP18、HSP23

4、.6。其它的與初級代謝和能量代謝相關(guān)基因5個；轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因2個；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因2個；蛋白質(zhì)修飾、加工相關(guān)基因9個；轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因2個；功能未知的Unigene有7個；4個Unigenes比對同源性非常低：4個Unigenes在數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)任何同源性。
　　 進(jìn)一步對所得的Unigenes分析發(fā)現(xiàn)：鈣信號在甘藍(lán)抗熱過程中起到了一定的作用，并與外界的非生物脅迫存在某種相同的機制，但具體機制還不清楚；泛素-蛋白酶體途徑在植物熱激