補體C3在李斯特菌感染模型中調節(jié)CD8+T細胞應答收縮和記憶形成.pdf

1、在胞內菌和病毒感染后，特異性CD8+T細胞在接收抗原呈遞細胞(APCs)傳遞的抗原信號，共刺激信號和細胞因子信號后發(fā)生分裂增殖分化為效應細胞，細胞數量迅速擴增在感染后7-8天左右達到高峰。隨后大部分效應CD8+T細胞發(fā)生凋亡，約10％左右存活下來并逐漸轉變?yōu)殚L期存活的記憶細胞。根據特異性CD8+T細胞應答動力曲線，可以將整個應答過程劃分為效應期、收縮期和記憶期。效應期CD8+T增殖的同時伴隨細胞分化為效應細胞并趨化至感染部位清除病原。收

2、縮期和記憶期的意義在于機體可以避免應答過度導致病理性損傷，也可以保持靈活性以應對新的病原感染。記憶細胞則可以在相同病原再次感染時發(fā)揮更強的保護性免疫應答，所以針對收縮期和記憶期的調節(jié)機制具有重要的生理意義。補體是參與抵御病原感染的天然免疫的一個重要的組成部分，近年很多文獻報道補體具有更廣泛的生理作用，其中包括調節(jié)適應性免疫。補體除了在多個階段多種層次上調節(jié)B細胞免疫外，還可以調節(jié)T細胞的分化、增殖、凋亡等。目前有研究發(fā)現(xiàn)在移植和病毒感染

3、模型中補體可調節(jié)CD8+T細胞初次應答，但是對于補體是否可以調節(jié)CD8+T細胞應答收縮和記憶形成還不是很清楚。
　　我們利用胞內菌減毒的李斯特菌(△rLm-OVA)系統(tǒng)性感染C3缺陷（C3-/-）小鼠，并胞內IFN-γ流式染色方法和Kb/OVA pentamer方法檢測其特異性CD8+T細胞應答動力學變化。實驗均發(fā)現(xiàn)盡管C3-/-小鼠中CD8+T細胞初次應答比WT對照小鼠要低，但其CD8+T細胞應答收縮相對減少并伴隨記憶形成增多。

4、用烈性李斯特菌(rLm-OVA)感染C3-/-小鼠和WT對照，同樣發(fā)現(xiàn)了在C3-/-小鼠中特異性CD8+T細胞應答收縮相對減少和記憶形成增多。
　　眼鏡蛇毒因子(Cobra Venom Factor, CVF)處理小鼠可以消耗其循環(huán)或系統(tǒng)性補體C3。我們用CVF處理(-1-14天)小鼠后發(fā)現(xiàn)處理組小鼠循環(huán)補體C3水平降至正常水平的十分之一左右。結果顯示相對于對照小鼠，CVF處理小鼠內的特異性CD8+T細胞應答收縮減少和記憶形成增多

5、。因此，我們推測循環(huán)補體在李斯特菌感染模型中發(fā)揮主要的調節(jié)CD8+T細胞應答的作用。
　　之前很多文獻發(fā)現(xiàn)主要是在APC-T細胞局部產生的補體發(fā)揮調節(jié)T細胞免疫的作用。為了進一步明確是肝臟來源的系統(tǒng)性補體C3發(fā)揮主要作用或是單核-淋巴細胞來源的局部補體C3發(fā)揮主要的作用，我們采用骨髓嵌合小鼠來進行研究。骨髓嵌合小鼠中系統(tǒng)性補體C3來自受體小鼠，單核-淋巴細胞來源的局部補體C3來源于供體小鼠，可以用以區(qū)別系統(tǒng)性補體和局部補體的對特異

6、性CD8+T細胞免疫應答反應的調節(jié)作用。亞致死劑量的γ射線輻照WT和C3-/-小鼠受體小鼠后分別過繼轉移WT或C3-/-來源的骨髓細胞，總共形成四組。等骨髓重建2個多月后，對四組小鼠進行李斯特菌感染，并觀察其CD8+T細胞應答動力學變化。實驗結果顯示無論接受什么背景的骨髓細胞，C3-/-受體小鼠組的特異性CD8+T細胞應答收縮相比WT受體小鼠組減少。而同一背景小鼠分別接受了來自WT和C3-/-來源的骨髓細胞的后，兩組CD8+T細胞應答收

7、縮程度無顯著統(tǒng)計學差別。由此我們認為肝臟來源的系統(tǒng)性C3在調節(jié)CD8+T細胞應答收縮和記憶形成中發(fā)揮主要作用。
　　CVF干預系統(tǒng)性C3可以調節(jié)CD8+T細胞應答收縮和記憶形成。這提示了其在設計改善疫苗效果方面應用的可能性。我們想知道在C3缺陷(C3-/-)或CVF處理小鼠的條件下形成的記憶性CD8+T細胞功能情況。記憶性CD8+T細胞有著與初始CD8+T細胞和效應CD8+T細胞不一樣的表型和功能。首先，我們先檢測C3-/-與WT

8、小鼠中形成的記憶性CD8+T細胞表型表達。實驗結果顯示CD62L、KLRG-1、CD127、CD44，以及IL-2分泌能力都沒有顯著統(tǒng)計學差異。其次，我們過繼轉移用不同濃度CFSE標記的負載和不負載OVA肽的靶細胞至記憶期的C3-/-和WT小鼠，檢測其特異性CD8+T細胞的體內殺傷能力。結果顯示C3-/-小鼠內的靶細胞殺傷比例大于WT小鼠，與其特異性CD8+T細胞數差別一致，因此我們推測細胞平均殺傷能力在C3-/-和WT小鼠中并無明顯差

9、別。再次，CVF處理小鼠和對照小鼠在記憶期給予再次感染后，兩組小鼠中記憶性CD8+T細胞擴增速度一致，表現(xiàn)出相似的應答強度，表明C3被消耗情況下形成的CD8+T細胞再次應答能力與WT小鼠無差異。最后，同時分別將C3-/-和WT小鼠內的記憶性CD8+T細胞過繼轉移至未感染的野生小鼠中，感染后檢測兩組受體小鼠中過繼轉移的CD8+T細胞應答能力強弱差異。結果顯示來自C3-/-和WT的過繼轉移的記憶性CD8+T細胞增殖后擴增倍數無明顯統(tǒng)計學差異

10、。這些結果表明C3缺陷或被消耗的情況下生成的記憶性CD8+T細胞具有正常的表型和功能。
　　可以在CD8+T細胞應答效應期和收縮期發(fā)揮調節(jié)作用的因素不同。我們用CVF分別在效應期(-1-6天)或收縮期(7-14天)處理小鼠，試圖確定補體在哪個時期調節(jié)CD8+T細胞應答收縮和記憶形成。我們發(fā)現(xiàn)在效應期給予CVF處理小鼠的特異性CD8+T細胞應答收縮比對照減少，而收縮期CVF給予處理小鼠的CD8+T細胞應答收縮與對照無統(tǒng)計學差異。這一

11、結果表明C3主要在效應期對CD8+T細胞應答收縮和記憶形成發(fā)揮調節(jié)作用。接下來我們致力于分析已知在效應期可以塑造CD8+T細胞應答的因素是否參與C3對CD8+T細胞應答收縮和記憶形成的調節(jié)過程。
　　首先，有文獻報道在效應期后期持續(xù)存在的抗原可能影響CD8+T細胞應答收縮。我們在感染后第4天開始給小鼠喂飲抗生素水以清除效應期晚期(6～7天)可能存在細菌抗原。采用CFU實驗檢測小鼠脾臟內細菌滴度，結果提示效應期晚期細菌被完全清除。在

12、C3-/-小鼠體內的CD8+T細胞應答收縮仍有相對于WT明顯減少的差異，表明可以排除效應期后期持續(xù)存在的抗原的因素參與調節(jié)CD8+T細胞應答收縮的可能性。其次，特異性效應CD8+T細胞是一個異質性群體，由各種不同親和力的克隆構成。高親和力的克隆比低親和力的克隆更容易分化為短期存活的效應細胞，從而造成隨后的CD8+T細胞應答收縮更多。我們試圖檢驗C3-/-和WT小鼠在應答高峰期的效應CD8+T細胞的親和力是否存在差異導致CD8+T細胞應答

13、收縮程度不同。實驗結果顯示C3-/-小鼠和WT小鼠中特異性效應CD8+T細胞的TCR的Vβ譜無顯著差別，對不同滴度抗原的應答靈敏度在兩組中也沒有明顯統(tǒng)計學差異。這些結果說明特異性效應CD8+T細胞克隆的親和力與C3調節(jié)CD8+T細胞應答收縮和記憶形成無相關關系。從分析這些實驗結果可以提示抗原相關性因素不參與與C3調節(jié)CD8+T細胞應答收縮和記憶形成的過程。
　　隨后，我們發(fā)現(xiàn)應答高峰期的效應CD8+T細胞KLRG-1和CD127表

14、達在C3-/-小鼠和WT小鼠中有顯著差別。在C3-/-小鼠中有更少的效應CD8+T細胞分化為KLRG-1hiCD127low短期存活的效應細胞(SLECs)和更多的KLRG-1lowCD127hi記憶前體效應細胞(MPECs)。CVF處理后的小鼠在應答高峰期效應CD8+T細胞分化的亞群中KLRG-1hi細胞占比比對照組顯著減少。這些結果提示從效應CD8+T細胞分化的不同比例的SLECs與MPECs與兩組小鼠在隨后的CD8+T細胞應答收縮

15、和記憶形成存在顯著差異有相關性。已有很多研究支持效應期早期APCs提供的細胞因子第三信號在編程CD8+T細胞應答收縮和記憶形成中發(fā)揮主要作用。進一步，我們試圖觀察在感染后24小時的效應期早期C3-/-小鼠和WT小鼠中促炎細胞因子有無差別。我們在實驗中檢測到小鼠血清中IL-12，IFN-γ等促炎細胞因子水平在C3-/-小鼠中下降明顯。結合之前的結果，一種可能的關于C3如何調節(jié)CD8+T細胞應答的機制的解釋為:C3通過影響早期促炎細胞因子進

16、而調節(jié)效應CD8+T細胞分化，造成隨后的CD8+T細胞應答收縮和記憶形成的差別。
　　此外，在很多C3對T細胞免疫的研究中發(fā)現(xiàn)APC-T細胞來源的局部C3可通過C5aR發(fā)揮調節(jié)作用。最初，我們通過采用C5aR阻斷劑來阻斷C5aR信號通路并觀察李斯特菌感染后的特異性CD8+T細胞應答動力學變化。結果顯示C5aR阻斷劑處理組的CD8+T細胞應答收縮和記憶形成與對照組無顯著統(tǒng)計學差異。更進一步，我們采用C5aR敲除小鼠中來觀察C5aR信

17、號通路對特異性CD8+T細胞應答收縮和記憶形成的影響，結果顯示實驗組和對照組的特異性CD8+T細胞應答收縮也沒有統(tǒng)計學差別。這些結果提示在李斯特感染模型中，C3通過一種不依賴其下游C5aR信號通路的機制發(fā)揮對CD8+T細胞應答收縮和記憶形成的調節(jié)作用。
　　我們的研究發(fā)現(xiàn)了補體在調節(jié)CD8+T細胞應答收縮和記憶形成過程中扮演重要的角色，豐富了補體對于CD8+T細胞應答調節(jié)機制的認識，也加深了天然免疫和適應性免疫相互作用的理解。此外