Ezrin對(duì)UMR106細(xì)胞株生物學(xué)行為及移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的: 骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤。肺轉(zhuǎn)移是目前最常見的死亡原因，一旦發(fā)生預(yù)后明顯變差，不可切除的肺轉(zhuǎn)移死亡率幾乎達(dá)100％。如何提高肺轉(zhuǎn)移治愈率一直是臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。臨床上約50％患者的肺轉(zhuǎn)移是在治療過程中出現(xiàn)的。如果能在治療早期采用某種方法阻止肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，將明顯提高骨肉瘤的治愈率，是減少肺轉(zhuǎn)移致死率的最佳方法。 腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多環(huán)節(jié)共同參與的復(fù)雜過程，眾多活性因子參與其中。Ezrin

2、被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移各環(huán)節(jié)、各通路的中心調(diào)控因子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ezrin與多種惡性腫瘤的預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)。2001年，Khanna最先發(fā)現(xiàn)Ezrin在高轉(zhuǎn)移骨肉瘤細(xì)胞株明顯過度表達(dá)。后來，進(jìn)一步研究證實(shí)抑制Ezrin表達(dá)能顯著下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞在肺內(nèi)的存活能力。提示Ezrin可能成為基因治療抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)靶點(diǎn)。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是最近發(fā)展起來的一種高效的基因沉默技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、效率高、操作簡(jiǎn)單

3、、沉默程度可控、實(shí)驗(yàn)周期短、適用范圍廣、費(fèi)用低等無可替代的優(yōu)點(diǎn)。因而，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就得到了迅猛發(fā)展，現(xiàn)已廣泛用于基因功能、腫瘤、抗病毒治療等方面的研究。目前關(guān)于Ezfin參與腫瘤轉(zhuǎn)移方面的體內(nèi)研究主要采用的是實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型，由于模型動(dòng)物的限制不能如實(shí)反映臨床骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的過程，也不能研究Ezrin對(duì)原發(fā)灶的影響。因此本實(shí)驗(yàn)擬在以上研究的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建抑制Ezrin蛋白表達(dá)的shRNA干擾重組載體，下調(diào)UMR106大鼠骨肉瘤細(xì)胞株Ezfi

4、n蛋白的表達(dá)，體外研究干擾前后細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、粘附和侵襲能力的改變；并以大鼠原位骨肉瘤荷瘤鼠做為腫瘤模型，體內(nèi)觀察Ezrin蛋白干擾對(duì)骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移及原位瘤生長(zhǎng)的影響，為研究抑制骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的基因治療方法提供理論依據(jù)。 方法: (1)按照Elbashir等及Reynolds的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)并合成針對(duì)Ezrin蛋白編碼基因villin2的shRNA，并克隆入轉(zhuǎn)錄載體pGenesil-1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pshRNA1-viUin2

5、，pshRNA2-viUin2和pshRNAHK-villin2(陰性對(duì)照質(zhì)粒)；中量提取重組質(zhì)粒，采用Lipofectamine<'TM> 2000轉(zhuǎn)染UMR1069胃肉瘤細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR和Western Blot法分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)villin2基因的干擾效果。 (2)應(yīng)用干擾效果較好的質(zhì)粒大量轉(zhuǎn)染UMR106細(xì)胞，體外應(yīng)用MTT、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)和Transwell小室分別研究Ezrin蛋白干擾后細(xì)胞增殖、粘附

6、、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的變化。 (3)采用LYMR106細(xì)胞原位移植法構(gòu)建高肺轉(zhuǎn)移率的大鼠骨肉瘤模型。分別用無血清培養(yǎng)基和鼠尾膠稀釋擴(kuò)增培養(yǎng)的UMR106細(xì)胞形成混懸液，原位移植至3周齡SD大鼠脛骨近端骨髓腔內(nèi)，并給予免疫抑制劑和抗感染藥物。觀察肢體成瘤及肺內(nèi)轉(zhuǎn)移情況，X線檢查骨質(zhì)改變狀況，HE染色組織學(xué)檢查確定病變性質(zhì)。 (4)應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的UMR106細(xì)胞并進(jìn)行大量擴(kuò)增，按照(3)的方法建立SD大鼠原位

7、移植骨肉瘤，以正常細(xì)胞及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的移植模型做對(duì)照，觀察原位腫瘤出現(xiàn)時(shí)間、大鼠生存時(shí)間及肺轉(zhuǎn)移的差異，并采用熒光顯微鏡和RT-PCR技術(shù)研究Ezrin蛋白被干擾細(xì)胞的體內(nèi)分布。 結(jié)果: (1)成功構(gòu)建三個(gè)重組質(zhì)粒，分別為pshRNA1-villin2、pshRNA2-villin2和通用陰性對(duì)照質(zhì)粒pshRNAHK-villin2；應(yīng)用Lipofectamine<'TM>2000將上述重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至UMR1

8、06骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90％。RT-PCR檢測(cè)顯示villin2基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平被顯著抑制，pshRNA1-vinin2和pshRNA2-Villin2分別抑制到正常細(xì)胞的23.12％和30.25％。Western Blot檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR相似，pshRNA1-vinin2和pshRNA2-villin2分別將Ezrin蛋白抑制到正常細(xì)胞的12.32％和25.56％，pshRNA1-villin2干擾效果較好。

9、 (2)以重組質(zhì)粒pshRNA1-villin2轉(zhuǎn)染UMR106細(xì)胞干擾Ezrin蛋白表達(dá)后細(xì)胞發(fā)生以下變化：①細(xì)胞增殖能力減弱，增殖抑制率達(dá)26.63％±20.65％；②細(xì)胞粘附力降低，僅為正常細(xì)胞的52.9％；③細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及侵襲能力均降低，抑制率分別45.34±5.91％和50.69±5.96％。 (3)UMR106細(xì)胞混懸液原位移植SD大鼠脛骨近端骨髓腔成功構(gòu)建了高肺轉(zhuǎn)移的大鼠骨肉瘤模型，原位成瘤率及肺轉(zhuǎn)移率均達(dá)100％。

10、X線檢查示明顯骨質(zhì)破壞和瘤骨形成，組織學(xué)檢查見腫瘤樣骨基質(zhì)形成，符合臨床骨肉瘤各項(xiàng)特征。培養(yǎng)基稀釋組較鼠尾膠稀釋組腫瘤形成時(shí)間早(10.0±1.65天 vs 17.8±0.87天，p<0.0001)，肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目多(155.25±36.63個(gè)vs 91.5±29.56個(gè)，p<0.0001)，大鼠生存時(shí)間短(21.4±6,67天 vs40.6±9.52天，p<0.0001)。 (4)以重組質(zhì)粒pshRNA1-villin2轉(zhuǎn)染UM

11、R106細(xì)胞，G418篩選并擴(kuò)增培養(yǎng)2個(gè)月，UMR106的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞達(dá)細(xì)胞總數(shù)的50％以上，RT-PCR檢測(cè)示mRNA為正常細(xì)胞的60.25％，Western Blot檢測(cè)Ezrin蛋白降至正常細(xì)胞的50.56％。將篩選后細(xì)胞原位移植大鼠脛骨近端，結(jié)果證實(shí)：①Ezrin蛋白干擾后并未影響UMR106細(xì)胞原位腫瘤的形成，成瘤時(shí)間與正常細(xì)胞組和陰性對(duì)照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(10.17±0.90天 vs 10.17±0.95天和10.08±0.

12、88天，p>0.05)；②存活時(shí)間較正常細(xì)胞組和HK陰性對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(42.8±17.28天 vs 21.3±6.72天和22.4±7.42天，p<0.0001)；③肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目明顯少于正常細(xì)胞組和HK陰性對(duì)照組(60.9±57.78個(gè) vs 120.4±41.92個(gè)和117.6±36.48，p<0.0001)；④熒光顯微鏡和RT-PCR檢測(cè)均證實(shí)Ezrin蛋白被干擾的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞只存在于原位瘤，而未轉(zhuǎn)移到肺組織。 結(jié)論:

13、 (1)重組質(zhì)粒pshRNA1-villin2、pshRNA2-villin2均能有效抑制UMR-106骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)Ezrin蛋白的表達(dá)，以pshRNA1一villin2干擾效果最好。 (2)Ezrin蛋白在細(xì)胞的增殖、粘附、運(yùn)動(dòng)和侵襲中起重要作用，Ezrin蛋白下調(diào)后可使細(xì)胞的上述能力減弱，轉(zhuǎn)移能力降低。 (3)UMR106細(xì)胞混懸液原位移植SD大鼠脛骨近端構(gòu)建的大鼠骨肉瘤模型肺轉(zhuǎn)移率高，適合于骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的研究。