肝素和白血病抑制因子對自制無血清代用品培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的作用.pdf

1、目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同濃度的肝素、白血病抑制因子(Leukemia inhibitoryfactor，LIF)對自制無血清代用品培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stemcells，mESCs)的影響，并探索肝素聯(lián)合LIF培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞的最佳濃度。
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)以自制無血清代用品為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、經(jīng)絲裂霉素C處理過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞。并觀察在此基

2、礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加肝素、LIF及肝素聯(lián)合LIF對小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)效果。
　　 1、觀察在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同濃度的肝素所培養(yǎng)的細(xì)胞的生長情況，初步明確肝素對小鼠胚胎干細(xì)胞生長的影響。
　　 2、觀察在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同濃度的LIF所培養(yǎng)的細(xì)胞的生長情況，明確LIF在自制無血清代用品中對小鼠胚胎干細(xì)胞生長的影響。并用AKP染色法檢測小鼠胚胎干細(xì)胞的未分化情況，同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測SSEA-1、SSEA-3以及細(xì)胞免

3、疫熒光法檢測Oct-4的表達(dá)情況。
　　 3、觀察在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入固定濃度的LIF和不同濃度的肝素所培養(yǎng)的細(xì)胞的生長情況，明確LIF和肝素在自制無血清代用品中共同對小鼠胚胎干細(xì)胞生長的影響，并用AKP染色法檢測小鼠胚胎干細(xì)胞的未分化情況，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測SSEA-1、SSEA-3的表達(dá)情況以及細(xì)胞免疫熒光法檢測Oct-4的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、在自制無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞不能貼

4、壁，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長細(xì)胞逐漸死亡或是過度分化。在上述培養(yǎng)基中加入一定量肝素所培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞能夠貼壁生長，同時(shí)對干細(xì)胞有一定的促增殖作用，呈現(xiàn)劑量依賴性，在該部分實(shí)驗(yàn)中以100ng/ml這一濃度下的細(xì)胞生長狀態(tài)最佳，最高可傳代6代。
　　 2、在自制無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一定量LIF能夠明顯促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞的貼壁生長，并能較好的維持未分化狀態(tài)生長。10ng/ml這一濃度下培養(yǎng)的細(xì)胞生長狀態(tài)較好，連續(xù)傳6代未見分化。取培養(yǎng)

5、第3代的小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行未分化檢測：流式細(xì)胞術(shù)檢測胚胎干細(xì)胞表面特異性抗原SSEA-1表達(dá)率為64.05％，SSEA-3的表達(dá)率為1.0％；AKP染色和細(xì)胞免疫熒光檢測Oct-4均為陽性結(jié)果。
　　 3、在自制無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加添加固定濃度的LIF和不同濃度的肝素培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞。以10ng/ml的LIF和100ng/ml的肝素共同培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞的生長狀態(tài)最佳，連續(xù)傳6代未見分化。取培養(yǎng)第3代的小鼠胚胎干細(xì)胞做未

6、分化檢測：流式細(xì)胞術(shù)檢測胚胎干細(xì)胞表面特異性抗原SSEA-1表達(dá)率為82.49％，SSEA-3的表達(dá)率為2.15％，AKP染色和細(xì)胞免疫熒光檢測Oct-4均為強(qiáng)陽性結(jié)果。
　　 結(jié)論：
　　 1、自制無血清代用品中添加肝素后有益于小鼠胚胎干細(xì)胞貼壁，并維持小鼠胚胎干細(xì)胞的生長，其生長能力與肝素的濃度呈正比關(guān)系，但經(jīng)多次傳代后出現(xiàn)易分化傾向。
　　 2、自制無血清代用品中添加LIF有益于小鼠胚胎干細(xì)胞貼壁，并維持小

7、鼠胚胎干細(xì)胞的生長。當(dāng)LIF的濃度低于100aag/ml時(shí)，小鼠胚胎干細(xì)胞的生長能力與LIF的濃度呈正比關(guān)系。但當(dāng)LIF的濃度為100ng/ml時(shí)抑制細(xì)胞的生長。
　　 3、自制無血清代用品中添加10ng/ml的LIF和不同濃度的肝素均有益于小鼠胚胎干細(xì)胞貼壁，并維持小鼠胚胎干細(xì)胞的生長，其生長能力與肝素的濃度呈正比關(guān)系。當(dāng)肝素的濃度為100ng/ml時(shí)，小鼠胚胎干細(xì)胞的生長情況最佳，經(jīng)多次傳代細(xì)胞未見明顯分化。說明在自制無血清