肝素和白血病抑制因子對自制無血清代用品培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的作用.pdf

1、目的：
　　 本實驗旨在研究不同濃度的肝素、白血病抑制因子(Leukemia inhibitoryfactor，LIF)對自制無血清代用品培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stemcells，mESCs)的影響，并探索肝素聯(lián)合LIF培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞的最佳濃度。
　　 方法：
　　 實驗以自制無血清代用品為基礎培養(yǎng)基、經絲裂霉素C處理過的小鼠胚胎成纖維細胞為飼養(yǎng)層培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞。并觀察在此基

2、礎培養(yǎng)基中分別添加肝素、LIF及肝素聯(lián)合LIF對小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)效果。
　　 1、觀察在基礎培養(yǎng)基中加入不同濃度的肝素所培養(yǎng)的細胞的生長情況，初步明確肝素對小鼠胚胎干細胞生長的影響。
　　 2、觀察在基礎培養(yǎng)基中加入不同濃度的LIF所培養(yǎng)的細胞的生長情況，明確LIF在自制無血清代用品中對小鼠胚胎干細胞生長的影響。并用AKP染色法檢測小鼠胚胎干細胞的未分化情況，同時應用流式細胞術檢測SSEA-1、SSEA-3以及細胞免

3、疫熒光法檢測Oct-4的表達情況。
　　 3、觀察在基礎培養(yǎng)基中加入固定濃度的LIF和不同濃度的肝素所培養(yǎng)的細胞的生長情況，明確LIF和肝素在自制無血清代用品中共同對小鼠胚胎干細胞生長的影響，并用AKP染色法檢測小鼠胚胎干細胞的未分化情況，同時流式細胞術檢測SSEA-1、SSEA-3的表達情況以及細胞免疫熒光法檢測Oct-4的表達情況。
　　 結果：
　　 1、在自制無血清的基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞不能貼

4、壁，隨著培養(yǎng)時間延長細胞逐漸死亡或是過度分化。在上述培養(yǎng)基中加入一定量肝素所培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞能夠貼壁生長，同時對干細胞有一定的促增殖作用，呈現(xiàn)劑量依賴性，在該部分實驗中以100ng/ml這一濃度下的細胞生長狀態(tài)最佳，最高可傳代6代。
　　 2、在自制無血清的基礎培養(yǎng)基中添加一定量LIF能夠明顯促進小鼠胚胎干細胞的貼壁生長，并能較好的維持未分化狀態(tài)生長。10ng/ml這一濃度下培養(yǎng)的細胞生長狀態(tài)較好，連續(xù)傳6代未見分化。取培養(yǎng)

5、第3代的小鼠胚胎干細胞進行未分化檢測：流式細胞術檢測胚胎干細胞表面特異性抗原SSEA-1表達率為64.05％，SSEA-3的表達率為1.0％；AKP染色和細胞免疫熒光檢測Oct-4均為陽性結果。
　　 3、在自制無血清的基礎培養(yǎng)基中添加添加固定濃度的LIF和不同濃度的肝素培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞。以10ng/ml的LIF和100ng/ml的肝素共同培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞的生長狀態(tài)最佳，連續(xù)傳6代未見分化。取培養(yǎng)第3代的小鼠胚胎干細胞做未

6、分化檢測：流式細胞術檢測胚胎干細胞表面特異性抗原SSEA-1表達率為82.49％，SSEA-3的表達率為2.15％，AKP染色和細胞免疫熒光檢測Oct-4均為強陽性結果。
　　 結論：
　　 1、自制無血清代用品中添加肝素后有益于小鼠胚胎干細胞貼壁，并維持小鼠胚胎干細胞的生長，其生長能力與肝素的濃度呈正比關系，但經多次傳代后出現(xiàn)易分化傾向。
　　 2、自制無血清代用品中添加LIF有益于小鼠胚胎干細胞貼壁，并維持小

7、鼠胚胎干細胞的生長。當LIF的濃度低于100aag/ml時，小鼠胚胎干細胞的生長能力與LIF的濃度呈正比關系。但當LIF的濃度為100ng/ml時抑制細胞的生長。
　　 3、自制無血清代用品中添加10ng/ml的LIF和不同濃度的肝素均有益于小鼠胚胎干細胞貼壁，并維持小鼠胚胎干細胞的生長，其生長能力與肝素的濃度呈正比關系。當肝素的濃度為100ng/ml時，小鼠胚胎干細胞的生長情況最佳，經多次傳代細胞未見明顯分化。說明在自制無血清