人工冬蟲夏草在特發(fā)性肺纖維化的體外干預作用和機制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一組慢性、進行性、致纖維化性間質(zhì)性肺疾病，是多種肺部疾病的最終轉(zhuǎn)歸。特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是PF中最常見的類型，其病因未明，好發(fā)于老年人。IPF以進行性呼吸困難及肺功能惡化為主要臨床表現(xiàn)，其組織病理學及胸部影像學特征性表現(xiàn)為尋常型肺間質(zhì)性肺炎（Usual interstitial pneumo

2、nia，UIP）。IPF預后不良，診斷后平均中位生存期僅為2.8-3.5年，5年死亡率高達80％，患者往往死于肺部本身疾病的進展。既往ATS/ERS對IPF推薦的治療方案是以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合硫唑嘌呤和/或環(huán)磷酰胺為基礎的抗炎治療，但臨床上僅有10%的患者受益，且長期應用糖皮質(zhì)激素和/或免疫抑制劑治療并不能改善IPF患者的生存率、疾病進程和預后。遺憾的是，除了肺移植外，迄今為止尚未有確切有效的藥物用于治療IPF。因此研究和開發(fā)治療IPF的藥

3、物研究具有非常重要的意義。
　　冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)藥用真菌，具有益精髓、補虛損、保肺益腎等功效?，F(xiàn)代研究表明具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等多種藥理作用，對腎臟、肝臟、肺臟、心臟和腦血管等重要臟器有保護作用。冬蟲夏草的臨床應用廣泛，但由于產(chǎn)量有限，無法滿足日益增長的臨床需要和保健需要。人工冬蟲夏草（百令膠囊）是以中華束絲孢為生產(chǎn)菌種人工培育、分離、發(fā)酵精制而成，與天然冬蟲夏草具有相似的有效化學成分

4、，包括多糖類、核苷酸類、甘露醇、麥角甾醇類、氨基酸等。研究表明，人工冬蟲夏草在慢性支氣管炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺結核等多種肺部疾病有良好的治療作用，對肝纖維化、腎纖維化、腹膜纖維化等器官纖維化有一定的防治作用。人工冬蟲夏草在實驗性肺纖維化動物模型的干預作用也有初步的探討，其作用機制可能與抑制TGF-β1在肺組織中的表達，調(diào)整I型/II型細胞因子平衡有關；我們前期實驗結果也證實人工冬蟲夏草對博萊霉素所致大鼠肺纖維化有明顯的抗纖維化作

5、用，一方面，人工冬蟲夏草對博萊霉素所致肺損傷早期有明顯的保護作用，其機制可能是通過減少肺纖維化早期BALF細胞總數(shù)，降低中性粒細胞和淋巴細胞百分比，降低肺組織肺泡炎，降低BLAF中的LDH、TNF-α含量，下調(diào)MDA、iNOS水平，提高GSH含量而達到早期抗炎、抗氧化作用；另一方面應用人工冬蟲夏草與糖皮質(zhì)激素聯(lián)用具有協(xié)同治療作用，可能通過抑制PDGF，bFGF，TNF-α等細胞因子而達到減弱纖維化作用，且可減少糖皮質(zhì)激素的用量。但是，人

6、工冬蟲夏草對人類IPF的治療作用和作用機制如何，目前尚未明確，因此我們設想，通過進一步研究人工冬蟲夏草對原代分離正常人和IPF患者成纖維細胞及II型肺泡上皮細胞系A549的干預作用，從而探討其對IPF治療作用及可能機制。本實驗分為兩部分，第一部分主要探討人工冬蟲夏草對肺成纖維細胞的干預作用及可能作用機制；第二部分主要探討人工冬蟲夏草對TGF-β1誘導下肺肌成纖維細胞活化的抑制作用及可能作用機制。
　　第一部分：人工冬蟲夏草對正常人

7、和IPF患者肺成纖維細胞的干預作用
　　目的：
　　探討人工冬蟲夏草對正常人和IPF患者肺成纖維細胞干預作用及作用機制。
　　方法：
　　原代分離、培養(yǎng)、鑒定正常人肺成纖維細胞（pulmonary fibroblast from health human，N-LFB）和特發(fā)性肺纖維化患者肺成纖維細胞（pulmonary fibroblast from idiopathic pulmonary fibrosis p

8、atient，IPF-LFB）及II型肺泡上皮細胞系A549。不同濃度（2.5mg/ml、5mg/ml、7.5 mg/ml、10 mg/ml和12.5 mg/ml）人工冬蟲夏草分別干預N-LFB、IPF-LFB和A54924h、48h和72h，MTT比色法檢測不同濃度人工冬蟲夏草對N-LFB、IPF-LFB和A549生長增殖影響；不同濃度人工冬蟲夏草（2.5mg/ml、5mg/ml、7.5 mg/ml和10 mg/ml）分別干預N-LF

9、B、IPF-LFB48h，應用realtime-PCR檢測人工冬蟲夏草對N-LFB、IPF-LFB中結締組織生長因子（CTGF）和I型前膠原（collagen type I alpha1，COL1A1）mRNA表達的影響。
　　結果：
　　1.人工冬蟲夏草能夠直接抑制正常人肺成纖維細胞、IPF患者肺成纖維細胞和II型上皮細胞系A549的生長增殖。
　　2.在一定干預濃度下（2.5~12.5mg/ml）下，人工冬蟲夏草對

10、N-LFB、IPF-LFB和A549生長增殖抑制作用具有時間依賴性和濃度依賴性，隨著干預時間的延長和藥物濃度的增加，人工冬蟲夏草對成纖維細胞和上皮細胞的抑制率呈上升趨勢，差異有極顯著性（p<0.01）。
　　3.人工冬蟲夏草對成纖維細胞的增殖抑制作用具有一定的細胞特異性，干預條件相同情況下，與N-LFB相比，對IPF-LFB具有更好的抑制作用。
　　4.人工冬蟲夏草可通過下調(diào)CTGF和COL1A1 mRNA表達，抑制細胞外基

11、質(zhì)的合成。
　　結論：
　　1.人工冬蟲夏草能夠直接抑制肺成纖維細胞的增殖，具有時效-量效關系；
　　2.人工冬蟲夏草對成纖維細胞的增殖抑制作用具有一定的細胞特異性，對病變部位來源的成纖維細胞有更好的抑制效應；
　　3.人工冬蟲夏草可通過下調(diào)CTGF和COL1A1 mRNA表達，抑制細胞外基質(zhì)的合成，具有濃度依賴性；
　　第二部分：人工冬蟲夏草對TGF-β1誘導下IPF患者肺成纖維細胞向肺肌成纖維細胞活化的

12、抑制作用及可能機制
　　目的：
　　研究人工冬蟲夏草對TGF-β1誘導下IPF患者肺成纖維細胞向肺肌成纖維細胞活化的抑制作用及可能作用機制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)A549和IPF-LFB，以5ng/ul TGF-β1誘導A549和IPF-LFB向肺肌成纖維細胞（pulmonary myofibroblast，MF）轉(zhuǎn)分化。不同濃度人工冬蟲夏草（2.5mg/ml、5mg/ml、7.5 mg/ml、10 mg/m

13、l和12.5 mg/ml）分別干預TGF-β1誘導下A549和IPF-LFB生長增殖24h、48h和72h。MTT比色法檢測不同濃度人工冬蟲夏草對TGF-β1誘導下 A549和IPF-LFB增殖活化的抑制作用。取10 mg/ml人工冬蟲夏草為最適干預濃度，Western-blotting檢測人工冬蟲夏草對TGF-β1誘導下A549和IPF-LFB向MF轉(zhuǎn)化過程中和已轉(zhuǎn)化MF后Smad3蛋白表達影響；Real-time PCR檢測人工冬蟲

14、夏草對TGF-β1誘導下A549和IPF-LFB向MF轉(zhuǎn)化過程中和已轉(zhuǎn)化MF后血管生長因子（VEGF）、結締組織生長因子（CTGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、I型前膠原（collagen type I alpha1，COL1A1）mRNA表達影響。
　　結果：
　　1.不同濃度人工冬蟲夏草可抑制TGF-β1誘導下A549和IPF-LFB的增殖活化。隨藥物濃度和干預時間延長，對A549和IPF-LFB的抑制呈上升趨勢

15、，具有時間和劑量依賴性。
　　2.10 mg/ml人工冬蟲夏草可抑制TGF-β1誘導下A549向MF轉(zhuǎn)分化過程中Smad3蛋白的核轉(zhuǎn)位，部分逆轉(zhuǎn)IPF-LFB已分化MF Smad3蛋白表達。
　　3.人工冬蟲夏草可下調(diào)TGF-β1誘導下和A549和IPF-LFB向MF轉(zhuǎn)分化和已分化MF中VEGF、CTGF、MMP-2、COL1A1 mRNA表達水平。
　　結論：
　　1.人工冬蟲夏草可抑制TGF-β1誘導下A54