CXCR-4基因轉(zhuǎn)染的BMMSCs對實驗性IBD小鼠腸黏膜修復機制研究.pdf

1、研究背景:
　　炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）作為一種病因及發(fā)病機制尚未完全明確的，以累及腸道為主的消化道慢性炎癥性疾病，在臨床上一般包括克羅恩病(Crohn's Disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)作為最早被人工分離出的成體干細胞，具有許

2、多生物學特點和優(yōu)勢，如:自身低免疫原性、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)作用、取材方便等，因此成為臨床上移植療法的推薦選擇之一，對IBD而言，因其可通過促進病變腸黏膜修復并糾正機體及局部的免疫功能紊亂，而成為治療本病的首選細胞。然而，經(jīng)靜脈移植的BMMSCs最終定植于病變腸黏膜的數(shù)量有限，限制了其治療作用的發(fā)揮。由于干細胞的歸巢行為涉及多種趨化因子及其受體的參與，其中趨化因子CXC亞組受體-4/基質(zhì)細胞衍生因子-1(Chemokine Recep

3、tor-4/Stromalcell-derived Factor-1，CXCR4/SDF-1)的作用已經(jīng)被證實在介導干細胞歸巢中發(fā)揮著十分重要的地位。故利用CXCR-4基因轉(zhuǎn)染BMMSCs，能夠使其在體內(nèi)的靶向性定位增強，從而提高療效。
　　實驗目的:
　　通過移植未經(jīng)修飾的BMMSCs和CXCR-4基因修飾的BMMSCs來比較兩者在治療實驗性IBD小鼠模型中腸道黏膜局部定植率及療效，并探討CXCR-4基因修飾的BMMSCs

4、促進受損腸黏膜愈合的機制，從而為臨床上確定一種選擇靶向性更強的干細胞用于治療IBD提供理論依據(jù)。
　　實驗內(nèi)容:
　　1、構(gòu)建并鑒定BMMSCs。
　　2、構(gòu)建并鑒定經(jīng)CXCR-4基因修飾的靶向性BMMSCs及評估其體外遷移率。
　　3、觀察經(jīng)CXCR-4基因修飾的BMMSCs能否向IBD小鼠損傷腸黏膜定向遷移并加快其愈合。
　　4、探討靶向性BMMSCs通過何種機制在腸道局部大量定植并發(fā)揮修復作用。

5、>　　實驗方法:
　　1、采用細胞貼壁分離法從雄性BALB/c小鼠(4-5周齡)的骨髓中分離并體外培養(yǎng)BMMSCs;并對BMMSCs進行熒光染料(CM-Dil)標記。
　　2、通過形態(tài)學觀察、流式細胞學技術(shù)檢測細胞表面標志物、成骨/成脂肪樣細胞誘導分化實驗對所培養(yǎng)的BMMSCs進行鑒定。
　　3、將攜帶CXCR-4的慢病毒轉(zhuǎn)染入BMMSCs構(gòu)建成CXCR4-BMMSCs;進行嘌呤霉素篩選實驗，從中提純CXCR-BMMS

6、Cs;采用Real time-PCR檢測并比較轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組的CXCR-4的表達量。
　　4、通過形態(tài)學觀察、流式細胞技術(shù)檢測細胞表面標志物、成骨/成脂樣細胞誘導分化實驗、臺盼藍拒染實驗間接測定細胞存活率、流式細胞學測定細胞周期，來比較兩組生物學特性的差異。
　　5、通過Transwell體外遷移實驗，比較兩組細胞向SDF-1的遷移率。
　　6、選擇雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)，分別隨機分為6組;①對照組（標記

7、為Control，Ctr組）:生理鹽水灌腸(0.1ml/只)，灌腸后第2天，給予尾靜脈注射不含BMMSCs的PBS0.1ml，n=20;(②)TNBS組（T組）:TNBS-乙醇灌腸劑(0.1ml/只)，并于造模后第2天，給予尾靜脈注射不含BMMSCs的PBS0.1ml，n=20;③BMMSC移植組(MT組):TNBS-乙醇灌腸劑(0.1ml/只)，并于造模后第2天，尾靜脈注射含BMMSCs（1×106/只）的PBS0.1ml,n=20;

8、④CXCR-BMMSC移植組（CMT組）:TNBS-乙醇灌腸劑(0.1ml/只),并于造模后第2天，給予尾注射含CXCR4-BMMSCs(1×106/只)的PBS0.1ml,n=20。移植當天標記為D0，移植后第1-13天，分別記為D1-13。
　　7、觀察各組小鼠一般情況、體重變化及存活率、進行臨床癥狀評分、肉眼及放大鏡下觀察結(jié)腸大體外觀、黏膜狀況，進行組織病理學評分。
　　8、分別于D0、D1、D3、D5、D7、D9、D

9、11、D13天采用頸椎脫臼法處死小鼠3只/組，并取材血液、腸道組織、腸系膜淋巴結(jié)及脾臟，一部分進行石蠟包埋，一部分經(jīng)液氮速凍后，-80℃冰箱保存。
　　9、熒光顯微鏡下觀察各組細胞在腸道內(nèi)的定植情況，應用Real time PCR檢測并比較Y染色體的性別決定區(qū)段(SRY)基因的腸道局部的相對量。
　　10、采用免疫組織化學檢測腸道干細胞標志物Lgr-5、腸道上皮間的緊密連接蛋白Occludin、血管生成指標VEGF的表達情況

10、。
　　11、采用Western Blot技術(shù)檢測PI3K的表達情況。
　　實驗結(jié)果:
　　1、采用貼壁分離法培養(yǎng)的BMMSCs隨著不斷純化其細胞形態(tài)呈長梭狀且按束狀排列，細胞表型鑒定顯示為:CD90.2+;CD105+;CD45-;CD11b-，成骨誘導可見明顯的骨結(jié)節(jié)形成，成脂肪誘導可見脂滴。經(jīng)熒光染料染色后對細胞的生物學特性無明顯影響。
　　2、將CXCR-4基因?qū)隑MSCs后，與BMMSCs組比較可檢測

11、到CXCR-4基因的高表達(p＜0.05);
　　3、CXCR-BMMSCs組細胞均呈長梭形并束狀排列;細胞袁型鑒定未發(fā)生改變(CD90.2+; CD105+; CD45-;CD11b-);成骨誘導可見明顯的骨結(jié)節(jié)形成，成脂肪誘導可見脂滴;活細胞比率均在90％以上;以上結(jié)果與未經(jīng)修飾的BMMSCs相比無明顯差異(p＞0.05);在細胞周期檢測中發(fā)現(xiàn)過表達CXCR-4基因的BMMSCs處于復制期的細胞增多(p＜0.05)。
　

12、　4、體外遷移實驗證實:在SDF-1的誘導下，CXCR-BMMSCs組的遷移率＞BMMSCs組(p＜0.05)。
　　5、TNBS-乙醇灌腸法誘導后的實驗性IBD小鼠模型的存活率明顯下降、小鼠精神狀態(tài)差且體重明顯下降，臨床癥狀及組織病理學評分上升，肉眼觀察可見結(jié)腸皺縮，局部腸段狹窄，腸黏膜伴有充血水腫、糜爛形成，黏膜及黏膜下層有大量中性粒細胞浸潤，與正常組比較均有明顯差異(p＜0.05);MT組、CMT組移植后第2天，與T組相比，

13、存活率開始上升，疾病癥狀減輕、體重回升，臨床癥狀及組織病理學評分下降(p＜0.05)，CMT組誘導緩解的效果更好(p＜0.05)。
　　6、熒光顯微鏡下可見MT組、CMT組的腸道組織均存在紅色熒光;治療組及雄性對照組的腸道黏膜組織中均能檢測到SRY基因;體內(nèi)定植率的比較顯示CMT組＞MT組。(p＜0.01)
　　7、免疫組織化學染色結(jié)果顯示:IBD模型小鼠接受BMSCs移植后，腸道干細胞標志物Lgr-5、腸道上皮間的緊密連接

14、蛋白Occludin及VEGF的表達量較造模未治療組有所升高。
　　8、Western Blot的結(jié)果顯示:與T組相比，MT組、CMT組PI3K的蛋白表達量均升高，其中CMT組升高最為明顯(p＜0.01)。
　　實驗結(jié)論:
　　1、利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染CXCR-4基因至BMMSCs，幾乎不會改變BMMSCs原有的生物學特性。
　　2、體內(nèi)外實驗均證實了CXCR-4基因的過表達可增加BMMSCs的遷移率。