通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)編輯斑馬魚hoxb4基因及其突變體基因型的初篩.pdf

1、目的：造血干細胞是一群具有高度的自我復制及多項分化潛能的最原始的造血細胞。人類HOXB4基因編碼一類具有同源盒DNA依賴的結(jié)構(gòu)域核蛋白，在造血干細胞的自我更新和分化過程中起到重要的調(diào)控作用。如何在體外擴增造血干細胞，使其既能保留其自我更新的特征又可以向不同血細胞分化是目前研究的重點和難點，調(diào)控其增殖和分化的因素和機制尚不明了，本課題采用高效基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9在基因組水平對斑馬魚的hoxb4基因進行編輯，并對其進行陽性突變

2、體的篩選，以期建立下調(diào)hoxb4基因的突變體斑馬魚模型，為進一步篩選其下游靶基因及探討對造血系統(tǒng)的作用機制提供實驗材料及理論依據(jù)。
　　方法：根據(jù)hoxb4基因的一號外顯子的正義鏈及反義鏈設計3個長約20bp的gRNA，分別靶向ExonI的192＃位點，244＃位點及313＃位點?；瘜W合成gRNA(guide RNA)寡核苷酸序列，經(jīng)過酶切克隆連入pT7-gRNA質(zhì)粒中，構(gòu)建gRNA的體外轉(zhuǎn)錄載體并通過體外轉(zhuǎn)錄得到靶位點的gRNA

3、。將質(zhì)粒pSP6-2sNLS-spCas9線性化后經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到Cas9的mRNA并進行添加A尾修飾，將以上靶位點的gRNA與Cas9的mRNA共注射入單細胞期的斑馬魚胚胎內(nèi)，提取靶序列基因組DNA，PCR擴增出靶序列并使用T7EI酶切測效，最后將PCR產(chǎn)物連入pMD19-T simple載體中，挑取陽性克隆進行菌落PCR鑒定，然后經(jīng)Sanger測序檢測突變類型。
　　結(jié)果：1.hoxb4靶序列基因組DNA的核酸擴增產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定

4、結(jié)果與預期相符；2.設計的敲除hoxb4靶點的gRNA寡核苷酸雙鏈成功連入pT7-gRNA質(zhì)粒中且經(jīng)堿基序列鑒定與預期相符；3.靶向hoxb4基因一號外顯子的313＃位點的gRNA成功編輯斑馬魚hoxb4基因，經(jīng)T7EI酶切檢測其敲除效率高達26.5％；4.313＃靶序列的核酸擴增產(chǎn)物成功連入pMD19-T simple載體中并經(jīng)測序篩選得到4種陽性突變型；5.有30%的斑馬魚可看到心包增大、心腔壁變薄及血流減緩血細胞減少的表現(xiàn)。